各级医疗机构医院裂头绦虫幼虫检测.pdf
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WS/T 5712017 1 1 范围 本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程 本标准适用于各级疾病预防控制机构、 医疗机构和食品检测机构对鱼、 蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检 测 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T 18088 出入境动物检疫采样标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 裂头蚴 plerocercoid larvae 裂头绦虫的幼虫，是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼 虫的总称（参见附录A） 3.2 阔节裂头蚴 plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或phyllobothrium latum 寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫 3.3 曼氏裂头蚴 plerocercoid larvae of Spirometra mansoni 寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。
4 仪器器材 各级医疗机构医院裂头绦虫幼虫检各级医疗机构医院裂头绦虫幼虫检测测 WS/T 5712017 2 4.1 生物显微镜 4.2 体视显微镜 4.3 PCR 扩增仪 4.4 电泳仪 4.5 凝胶成像系统 4.6 超净工作台 4.7 高速离心机 4.8 解剖用手术器械 5 试剂材料 5.1 试剂 胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE） ；琼脂糖凝胶；6加样缓冲液；1002000 bp DNA marker；灭菌双蒸馏水(ddH2O)；70%乙醇（配制见附录 B 的 B.1） 5.2 引物 扩增裂头蚴核糖体 DNA 转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素 C 氧化酶（Cox1）引物序 列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（见附录 B 的 B.2） 5.3 阳性对照 阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA 6 检测步骤 6.1 样品准备 6.1.1 样品种类：海鱼、淡水鱼、蛙和蛇 6.1.2 样品采集：采样按照 GB/T 18088 执行 6.2 样品检测 6.2.1 压片检查法 WS/T 5712017 3 用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条/只进行解剖。
取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表 面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物 的组织用载玻片压片，用生物显微镜镜检判定结果 6.2.2 蛋白酶消化法 称取样品 250 g 并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液 1:5 的比例加入消化液，37消化至无肉眼 可见的肉组织为止消化后用 0.8mm0.8mm（10 目）网筛过滤，滤液置于尖底量筒内，加水（用水参 照 GB/T 66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿，用体视显微镜镜检判定结果 6.2.3 核酸检测法 6.2.3.1 取样 在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用PCR 反应设立阳性对照，对照为裂头绦虫相应基因片 段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA无菌水作空白对照 6.2.3.2 DNA 的提取 （见附录 B 的 B.3） 6.2.3.3 反应体系 总体积为 25 L, 模板 DNA 2 L，上下游引物（10 mol/L）各 0.5 L，dNTPs 2 L，MgCl2 2.5 L， 10 Buffer 2.5 L，Taq 酶 (5 U/L) 0.2 L，补充 ddH2O 至 25 L。
6.2.3.4 PCR 反应程序 94预变性 3 min；94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 1 min ，35 个循环；72延伸 7 min 6.2.3.5 电泳 取 10 L 产物与 2 L 的 6加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶中在 1TAE 缓冲液中，3 V/cm4 V/cm 电泳约 30 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析 6.3 结果判定 6.3.1 裂头属的裂头蚴判定 若从鱼体内检出的幼虫大小若长 2mm20 mm，宽 2mm3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各 有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成 虫相似的头节，可初步判定裂头属的裂头蚴（参见附录 C） 6.3.2 迭宫属的裂头蚴形态判定 若从蛙或蛇体内检出的幼虫大小若长 0.5cm80 cm，宽 0.3cm1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫 体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的 WS/T 5712017 4 皱褶，可初步判定为迭宫属的裂头蚴（参见附录 C） 。
6.3.3 核酸扩增结果判定 6.3.3.1 目的基因扩增片段出现条带而空白对照未出现条带，实验结果成立 6.3.3.2 阔节裂头蚴特异引物扩增，出现 428 bp 的特征条带，初步判定该虫种为阔节裂头蚴 6.3.3.3 曼氏裂头蚴特异引物扩增，出现 156 bp 的特征条带，初步判定该虫种为曼氏裂头蚴 6.3.3.4 若要进一步对幼虫定种，需将引物扩增产物进行测序，将其序列与 GenBank 上序列进行比对 后定种 WS/T 5712017 5 A A 附 录 A （资料性附录） 病原学资料 裂头蚴（plerocercoid）是假叶目（Pseudophyllidea） 、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫的第三期幼 虫的总称裂头科中的裂头属（Dibothriocephalus）又名双叶槽属（Diphyllobothrium）及迭宫属 （Spirometra）的裂头蚴可感染人体 A.1 形态形态 A.1.1 裂头属的裂头蚴的形态 阔节裂头蚴长 2 mm20 mm，宽 2mm3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹 的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节， 裂头蚴皮层表面覆盖微毛，长度约 1.5 m。
A.1.2 迭宫属的裂头蚴形态 曼氏裂头蚴长 0.5cm80 cm，宽 0.3cm1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中 央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶 A.2 生活史生活史 阔节裂头绦虫成虫寄生在人以及犬、猫、猪等动物的小肠内虫卵随宿主粪便排出后，在 1525 的水中，经过 7d15d 的发育，孵出钩球蚴当钩球蚴被剑水蚤吞食后，在其血腔内经过 2 周3 周的发 育成原尾蚴 当受感染的剑水蚤被小鱼或幼鱼吞食后， 原尾蚴可在鱼的肌肉、 性腺、 卵内发育为裂头蚴， 裂头蚴并可随着鱼卵排出 当大鱼吞食含有裂头蚴的小鱼或鱼卵后， 裂头蚴可侵入大鱼的肌肉组织内继 续生存，直到终宿主食入带裂头蚴的鱼时，裂头蚴方能在其肠内经 5 周6 周发育为成虫成虫在终宿 主体内可活 5 年13 年 可感染阔节裂头蚴的第二中间宿主有： 白斑狗鱼 （Esox lucius） 、 江鳕 （Lota lota） 、 河鲈 （Perca fluviatilis） 、 三刺鱼 （Gasterosteus aculeatus） 、 樱花钩吻鲑 （Oncorhynchus masou） 、 鮻鱼 （Liza haematocheila） 、 溪红点鲑 （Salvelinus fontinalis） 、 虹鳟鱼 （Oncorhynchus mykiss） 、 雅罗鱼属鲤 （Leuciscus rutilus） 、八目鳗（Lampetra japonicum）等。
曼氏迭宫绦虫的成虫寄生在猫、犬及食肉野生动物为终宿主的小肠内，虫卵随宿主粪便排出体外， 在适宜温度下，经过 2 周5 周发育孵出六钩蚴，被剑水蚤吞食后发育成原尾蚴，原尾蚴被蛙类吞食可 发育成裂头蚴， 人吞食含有裂头蚴的第二中间宿主可引起曼氏裂头蚴病 可感染曼氏裂头蚴的第二中间 宿主为蛙类；鸟类、蛇类、猪可作为转续宿主 WS/T 5712017 6 B B 附 录 B （规范性附录） 与检测相关的技术方法 B.1 试剂配制 B.1.1 胃蛋白酶消化液 胃蛋白酶2 g，浓盐酸0.7 mL，加蒸馏水至100 mL，现用现配 B.1.2 Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE） 三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）242 g，冰乙酸57.1 mL，pH 8.0的 0.5 mol/L EDTA液100 mL， 加 蒸馏水定容至1000 mL，制成50 TAE缓冲液，混匀4保存备用临用前50倍稀释 B.1.3 1 TAE使用液 50 TAE 20 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，混匀备用 B.1.4 10 mg/mL溴化乙锭液 溴化乙锭1 g，加蒸馏水定容至100 mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。
B.1.5 1.5%琼脂糖凝胶 琼脂糖1.5 g，加1 TAE定容至100 mL，完全融化后，溶液冷却至60，加10 mg/mL 溴化乙锭5 L （终浓度0.5 g/mL)，轻轻混匀后，制备凝胶 B.1.6 6 加样缓冲液 溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g，加蒸馏水至100 mL置4保存备用 B.1.7 商品化试剂盒 Taq酶、dNTP等核酸提取及PCR试剂可选用商品化试剂和试剂盒 B.2 引物模板 裂头绦虫幼虫相关引物见表B.2 表B.2裂头绦虫幼虫相关引物 引物名称 引物编号 序列 片段大小/bp 裂头蚴 ITS 通用引物 18S-DF1 5-ACTTGATCATTTAGAGGAAGT-3 1409 28S-DR4 5-CTCCGCTTAGTGATATGCT-3 裂头蚴 Cox1 通用引物 JB6 5-GATAGTAAGGGTGTTGA-3 650 JB5R 5-CAAGTATCRTGCAAAATATTATCAAG-3 阔节裂头蚴特异引物 Dl/Dn-1805F 5-CAGTGGGAATGGTGCTTGTAATGT-3 428 WS/T 5712017 7 Dl-2211R 5-TAACCTTTACTTATAACTACT-3 曼氏裂头蚴特异性引物 F965 5-CTTGGCTTTATATGATTTAAATAG-3 156 R1120 5-GTTTGGTGCACAGTACGTTTTAAAA-3 B.3 DNA的提取 B.3.1 挑取单条待鉴定虫体放入灭菌离心管，加入灭菌蒸馏水，半小时换一次水，重复洗涤3次，洗涤 完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将离心管中虫体碾碎，加入180 l Buffer ATL，20 l蛋白酶K， 混匀后于56孵育13 h至消化完全，期间不时振荡摇晃。
B.3.2 消化完全后，漩涡震荡15 s，加200 l Buffer AL，立即漩涡振荡混匀，再加入200 l 乙醇 (9 6100%)，漩涡振荡混匀 B.3.3 离心柱置于收集管上，将上一步的混合物吸入离心柱中，8000 r/min离心 1 min，弃收集管 B.3.4 将离心柱置于新的收集管中，加500 l Buffer AW1，8000 r/min离心 1 min，弃收集管 B.3.5 将离心柱置于新的收集管中，加500 l Buffer AW2，14000 r/min离心 3 min，弃收集管 B.3.6 将离心柱置于灭菌的1.5 ml离心管中，加入200 l Buffer AE室温孵育1 min，8000 r/min离心 1 min，离心所得DNA于-20冰箱保存备用（重复该步骤可扩大DNA回收率） B.4 实验试剂代码解释（试剂盒自带） Buffer AL：裂解缓冲液（Lysis buffer） Buffe。
