cDNA文库建库流程.pdf
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生物秀实验频道——努力做您的实验助手！ htp:/ 中国生物科学论坛【生物秀论坛】 htp:/ 1 c cD N A 文 文库 库组 组标 标准 准流 流程 生 生物 物秀 秀搜 搜集 集整 整理 w w .b i o .c om 生物秀论坛 一. Total RNA 的提取................................................2 二. mRNA 的分离......................................................5 三．cDNA双链合成.....................................................7 四．载体制备..............................................................10 五. cDNA 双链和载体的连接..................................12 六．电转化流程..........................................................13 七．快速鉴定、菌落 PCR.........................................15 八．pBlueScript cDNA 库扩增..................................172 一.Total RNA 的提取 1.试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂 瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤 6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用 0.1‰DEPC 水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压 灭菌 3、 电泳槽及电泳托、梳子用 3%双氧水处理 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC 水：在 1000ml去离子水中加入 100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌 0.78M 柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳 22.94g 加 DEPC 水定容至 100ml，室温放置备用 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠 10g 加 DEPC 水定容至 100ml，室温放置备用 ▲变性裂解液： 0.78M 柠檬酸钠 8.25ml 10%肌氨酸钠 12.375ml 异硫氰酸胍 118.05g 加 DEPC 水定容至 250ml，室温放置备用 临用前加 β巯基乙醇使其终浓度为 1%（v/v） ▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5 NaAc∙3H2O 13.6g 加 DEPC 水定容至 50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M 醋酸钠 PH=5 NaAc∙3H2O 20.4g 加 DEPC 水定容至 50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲ 4M LiCL: LiCL 24.164g 加 DEPC水定容至 100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用 NaOH调 PH值至 8.0，定容到 100ml，高压灭菌，室温放置备用 ▲10X MOPS (3（N吗啉代）丙磺酸): MOPS 41.86g3 NaAC∙3H2O 4.10g 0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml 用 NaOH调 PH值 6.5 , DEPC 水定容到 1L，室温避光放置备用。
▲ 1x MOPS: 10x MOPS 30ml 加 DEPC水 270ml，用时现配 ▲4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油（高压过） 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨 310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 在 4℃ 可保持 3个月 ▲ 10x PBS pH=7.4 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g KH2PO4 2.4g 定容至 1000ml ▲变性电泳胶： 称取 0.5g琼脂糖，加入 47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至 50℃左右， 加入 2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上 ▲变性电泳缓冲液： 在 250ml容量瓶内加入 5ml甲醛，用 1x MOPS 定容至 250ml 2.动物组织 total RNA 的提取 1． 根据表 1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量， 将变性裂解液分装到 RNasefree 的 50ml无菌离心管中，冰浴 5分钟。
2． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆 1530秒/次，直到看不见组织和细胞碎 片 3． 根据表 1加入适量 2M 的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀 45次 4． 1 酚/氯仿,加盖颠倒混合 45次，再摇动 10秒钟 5． 冰浴 10 分钟 6． 4°C，12000g离心 20分钟 7． 小心转移上层水相于另一个 RNasefree 的无菌离心管中，内含所需的 RNA蛋白质 和 DNA分别留在了有机相和中间层 8． 加入等体积的异丙醇，20°C沉淀 30分钟以上 9． 4°C，12000g离心 20分钟 10． 根据表 1加入适量的变性裂解液重新溶解 RNA4 11． 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合 45 次，再摇动 10秒钟 12． 4°C，12000g离心 20分钟 13． 小心转移上层水相于另一个 RNasefree 的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，20°C 沉淀至少 30分钟 14． 4°C，12000g离心 20分钟 15． 弃上清，加 1ml75%的乙醇漂洗 RNA 沉淀4°C，12000g离心 10分钟 16． 清，空气中干燥 RNA沉淀，直至没有乙醇气味。
用适量 DEPC 水充分溶解 RNA 沉淀 17． 取少量 RNA用于测定 OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存 表 1 Mg# of tissue 500 800 1000 变性裂解液(ml) 5 8 10 2M NaOAC pH 4 (ml) 0.5 0.8 1 水饱和酚 (mL) 5 8 10 氯仿 (mL) 1 1.6 2 异丙醇(mL) 4 6 8 变性裂解液 (mL) 0.5 0.8 1 异丙醇(mL) 0.5 0.8 1 75% 乙醇(mL) 1 1 1 DEPCtreated H20 (mL) 0.5 0.8 1 3.植物组织 total RNA 的提取 1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将 1g样品在液氮中研磨成粉末状 2. 将粉末倒入盛有 3ml变性裂解液的 50ml离心管中，充分匀浆1g样品加入 3ml变性 裂解液） 3. 加入 0.3ml（1/10 体积）2M 的 NaAc（ph4－5）颠倒混匀 4. 3ml等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入 1ml（1/3）的氯仿，振荡 5. 冰浴 10min。
4℃，12000g离心 10min 6. 小心转移上清于另一离心管中，加入 2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少 1小时 7. 4℃，12000g离心 20min 8. 去上清，取沉淀加 1ml 4M 的 LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g 组织），并转入 1.5ml离心 管中 9. 4℃，13000rpm离心 15min 10.用 0.4ml DEPC 水溶解沉淀，加 1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀 11.4℃，13000rpm离心 10min 12.取上清，加 1/10 体积的 3MNaAc（ph5）和 2 倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀 30min 以上 13.4℃，13000rpm离心 15min 14.弃上清，用 1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心 10min 15.清，取沉淀，空气中干燥 RNA沉淀，直至无乙醇味 16.用 40－60ul DEPC 水溶解(300500ug/g)RNA沉淀 17.取少量 RNA用于测定 OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存5 4. TRIzol Reagent 提取 total RNA(GIBCO) 1． 查表 2 根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入 50ml RNasefree 离心管中， 注意样品体积不能超过 TRIzol Reagent 体积的 10%。
2． 将组织样品放入 TRIzol Reagent 中，高速下匀浆 1530秒/次，直至看不见组织和细胞 碎片 3．室温温育 10分钟 4． 据表 2 加入适量体积的氯仿，剧烈震荡 15秒钟，然后室温下温育 3分钟 5． 4ºC，12000g 离心 15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相 约占 TRIzol体积的 60% 6． 转移上清于另一个 Rnasefree 的 50ml离心管中根据表 2加入适量异丙醇，20ºC沉 淀 1小时以上 7． 4ºC,12000g离心 10分钟 8． 去上清，据表 2加入适量体积的 75%的乙醇混匀 9． 4ºC，7500g 离心 5分钟 10． 去上清，空气中干燥或真空抽干 RNA 沉淀，但不要太干加入适量体积的 DEPCWATER,溶解沉淀 11． 取少量 RNA用于测定其 OD值和电泳，其余置80ºC冰箱中保存 表 2 组织量 TRIzol Reagent 氯仿 异丙醇 75%乙醇 50~100mg 1ml 0.2ml 1ml 1ml 二.mRNA 的分离 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作： 1.将 Oligotex Suspension 置于 37℃水浴中，旋转混匀，溶解 Oligotex.,然后置于室温。
2. OB Buffer置于 37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温 3.将 OEB Buffer 置于 70水浴中，待用 试验步骤： 表 3：加入试剂量据此表 Total RNA RNasefre Water to: Bufer OBB (ul) Oligotex Suspension (ul) Prep size <=0.25mg 250ul 250ul 15 Mini6 0.250.5mg 500ul 500ul 30 Midi 0.50.75mg 500ul 500ul 45 Midi 0.751.00mg 500ul 500ul 55 Midi 1. Total RNA 量不要多于 1mg，用移液器取出所需 RNA 量到 1.5ml 离心管中，加 RNasefree water 补足到 500ul 2. 根据表 3加入适当体积的 OBB Buffer和 Oligotex Suspension，轻弹 1.5ml离心管 彻底混匀 3. 置于 70℃水浴中 3min 4. 取出置于室温（20℃－30℃）10min 5. 13000rpm 室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的 1.5ml 离心管中，保留 上清直到 polyA 被结合上。
6. 用移液器取 400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spi。
