乙型肝炎病毒感染模型应用新进展.doc

1乙型肝炎病毒感染模型应用新进展【关键词】 乙型肝炎病毒；感染模型；转基因技术乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染具有明显的种属特异性，是目前知道的最小的嗜肝 DNA 病毒，在易感宿主细胞内易于附着、侵入和复制，并可长期持续感染然而，HBV 的易感宿主范围很狭窄，仅限于人、黑猩猩等灵长类动物，故很难在普通实验动物中建立疾病模型因此，建立适合于 HBV 研究、简单易得的实验模型一直是研究者们追求的目标在过去的 20 多年间，国内外学者陆续建立了多种相应的嗜肝 DNA 病毒模型，但尚无一个理想的模型可准确地代表人HBV 感染的所有特征自转基因技术出现以后，HBV 转基因小鼠的研制使 HBV研究取得了很大的发展近年来，人 鼠嵌合模型的研究成为热点本文将从细胞模型和动物模型两方面对模型在 HBV 研究中的应用作系统综述HBV 感染基因及原代培养的细胞模型细胞模型目前研究的有人肝癌细胞和 HBV 感染原代培养的肝细胞两个模型人肝癌细胞模型有三个不同的细胞系建株：①PLC/PRF/5 细胞系，由人肝癌细胞建株，具有不产生清蛋白，不含 HBV DNA 的游离分子（所有 HBV DNA 分子均整合到细胞 DNA 中），只表达少量 HBsAg，不产生抗壳抗原和 Dane 颗粒等特点，故此细胞系主要用于研究感染 HBV 后，相关细胞因子对肝脏细胞的生物学效应，如抑制因子对肝细胞的作用［1］；也可用于一些抗病毒药物的研究，如反义寡核苷酸等对 HBsAg 的抑制作用［2］。

②HepG2 细胞系，是由肝胚瘤细胞的活体组织建株，通过转染 HBV 全基因到肝癌细胞，具有肝细胞所特有的绝大部分功能，可分2泌多种血浆蛋白和表达 HBsAg 和 HBeAg，主要用于 HBV DNA 结构与功能、HBV 对肝细胞的作用、抗病毒药物与 HBV 感染的关系等研究［3］③HepG2.2.15细胞系，则是应用重组载体 pDOLT HBV 1 转染 HepG2 细胞，可获得稳定分泌病毒蛋白和病毒颗粒的细胞克隆，这个细胞系能稳定分泌大量的 HBsAg、HBeAg和 Dane 颗粒，细胞内可检到 HBV DNA 和 RNA，但无 cccDNA细胞中不同部分整合的分子，含有头－尾连接的拷贝，也含有 cDNA 和单链 DNA，因此，HepG2.2.15 细胞系成为应用最广泛的乙型肝炎细胞模型［4］此外，HepG2.2.15细胞系可持续长时间地维持病毒复制，经多代培养仍保持病毒复制，病毒复制水平较低，但因其可分泌 HBsAg、HBeAg、HBV DNA 和完整的病毒颗粒，故还可用于抗 HBV 感染基因治疗的研究［5］尽管如此，HepG2.2.15 细胞系仍然存在以下问题，致使其应用受到一定限制，即 HBV 是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不同，且不能被清除；病毒复制的水平不能人为改变；病毒复制水平较低；细胞培养中不产生 cccDNA。

而 HBV 感染原代培养的肝细胞模型是在原代正常人肝细胞培养中加入含 HBV 颗粒的血清或在正常鸭肝细胞培养中加入DHBV，均可构建 HBV 感染的原代培养肝细胞模型Springzl 等［6］利用Ad HBV 1.3 分别感染人原代肝细胞、小鼠肝细胞、大鼠肝细胞、树鼩肝细胞、鸭肝细胞和 HepG2 细胞，应用 southern、northern、western blot 等方法评价发现该细胞系与 HepG2.2.15 细胞系相比，具有高效转移、表达 cccDNA，可对 HBV 突变和表达进行人为调控等优点，故主要用于研究 HBV 对正常人肝细胞附着、HBV病毒早期感染过程、DHBV 外膜蛋白抗体的抗感染作用以及抗病毒药物筛选等但是，DHBV 与 HHBV 的基因结构存在差异，其结果的应用受到一定限制建立感染 HBV 动物模型的研究现状3黑猩猩是 HBV 研究最具有代表性的动物模型，因为在所有动物中，灵长类与人类具有最近的亲缘关系，而黑猩猩与人类的亲缘关系最接近受 HBV 感染的黑猩猩绝大部分出现典型急性乙肝症状，细胞免疫反应与人类相似，因此可用于进行急性乙型肝炎机体免疫和肝脏病理方面的研究；少部分形成慢性感染，又可用来研究 HBV 持续感染的机制。

但由于黑猩猩属濒危动物、来源困难、价格昂贵，且不易诱发重症与癌变，应用受到限制产于我国云南、广西一带的低等小型灵长类动物 树鼩，在生理机能、生化代谢和基因组成等方面与人类具有相似性，是目前已知除黑猩猩外唯一能感染人 HBV 的动物品系，而且树鼩比较能适应实验环境，因此，树鼩有望成为 HBV 感染的实验小动物模型有资料报道用人 HBV 接种树鼩发现肝脏细胞内有 HBV DNA 复制，血清 ALT 明显升高可见树鼩可用于研究 HBV 感染机制、抗 HBV 药物筛选、乙肝疫苗安全性和免疫效果评价等然而，树鼩目前多以野生繁殖为主，捕获后短期饲养便进行实验，实验结果稳定性较差此外，树鼩感染人 HBV 后转为慢性感染的成功率尚待提高［7］目前研究发现一些禽类和哺乳类动物都可感染 HBV因此建立嗜肝 DNA 病毒动物模型倍受重视目前研究较多的是鸭乙型肝炎病毒（DHBV）是禽类嗜肝 DNA 病毒，其核酸组成与人 HBV 仅有 40%～70%同源性，无 X 开放读码框，膜蛋白基因只编码非糖基化的大、小蛋白，无中蛋白鸭子是 DHBV 的自然宿主，其自然感染方式主要为垂直传播，因此，先天性或幼年感染的雏鸭可发展为持续性 DHBV 感染。

国内各地采用当地成熟或雏鸭建立模型，如广州麻鸭、北京麻鸭等尽管 DHBV 进入鸭肝细胞的分子机制可能与人不尽相同，但是通过对 DHBV 模型的研究，在一定程度上阐述了乙肝病毒的复制机制和共价闭合环状 DNA（cccDNA）的作用DHBV 模型也可用来评价临床前期抗病毒药物，如核苷类似物、反义寡核苷酸等4治疗效果［8］虽然鸭感染 DHBV 的具体特征与人类感染 HBV 有一定差异，但是鸭易于孵育饲养、经济、易得，并能建立病毒持续感染和提供一个与 HBV 相似的体内实验系统，因此，鸭乙型肝炎病毒模型被广泛应用土拨鼠肝炎病毒（WHV）是哺乳类嗜肝 DNA 病毒，与人 HBV 基因组 DNA 序列同源性高于 DHBV，约为70%以上，且基因组结构也相似慢性感染 WHV 的土拨鼠可发展为重症肝炎和肝癌，其表现明显类似于人类感染 HBV，且仅在肝、脾中发现有 WHV DNA 复制中间体和 WHV RNA，故土拨鼠适用于研究 HBV 慢性感染的发病机制和抗乙肝病毒药物研究［9］但土拨鼠来源困难，我国西北地区自然存在与土拨鼠同种同属的“旱獭”，可用于构建 HBV 感染的动物模型张珺等［10］的研究结果显示，新疆灰旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原检出率达 82.2%，提示可以利用我国丰富的旱獭资源建立 HBV 感染的动物模型方面研究。

然而，WHV 与 HBV 在分类、结构和生物学功能等方面不完全相同，故 WHV 动物模型在研究 HBV 感染机理及复制过程中的应用受到一定限制复制转染 HBV 小鼠模型的临床意义Chisari 等使用显微注射法首次建立了 HBV 转基因小鼠模型，目前该模型可分为 HBV 部分序列、全基因序列和超长序列转基因鼠模型HBV 部分序列转基因小鼠模型只表达单一基因产物，不能产生病毒，因此不适宜用于病毒复制的研究而屠亚军等［11］所建立的人 HBVx 基因转基因小鼠模型，可用于研究慢性乙型肝炎患者诱发肝癌的机制及 HBX 的反式激活机制HBV 全基因或超长序列转基因小鼠具有病毒 DNA 复制及蛋白质合成的能力，能产生较高水平的血清 HBsAg及 HBeAg，血清中可检出 HBV DNA，认为该类模型可用于评价抗病毒药物的疗5效作为一种新策略，siRNA 显示了潜在的良好的治疗效果，它通过降解与目的基因相似的双链 RNA 可致靶基因沉默，针对 HBV 的 siRNA 可通过重组腺病毒载体有效地进入转基因小鼠的肝脏，完全抑制转基因鼠中 HBV 达 4 周之久，显示了 siRNA 的治疗效果［12］宿主对 HBV 感染产生免疫耐受，但不引发体内的免疫清除，这是 HBV 感染后形成慢性化的主要机制之一。

因转基因小鼠对 HBV 抗原处于免疫耐受状态，还可用于研究感染慢性化的形成机理熊一力等［13］在研究树突状细胞的抗原提呈功能时，发现转基因小鼠对 HBV 的抗原提呈能力低下，同时观察到小鼠的 T 淋巴细胞免疫活化受到抑制，鼠肝细胞应答能力下降，由此推测树突状细胞的抗原提呈能力下降，是宿主对 HBV 产生免疫耐受的关键此外，转基因小鼠还可用于慢性 HBV 携带者的免疫反应缺陷机理、HBV 持续感染中抗原提呈细胞作用规律等方面的研究尽管 HBV 转基因小鼠模型在研究 HBV 感染时显示了非常好的优势，但仍存在一些缺陷：①HBV 转基因小鼠的 HBV DNA 虽完全整合到小鼠基因组上，但与 HBV 自然感染人体的状态有所不同；②转基因小鼠具有遗传不稳定性；③鼠肝内缺乏 cccDNA 病毒转录模板的形成，进入鼠肝细胞内的 HBV 复制时不具有完整的生活周期，不能完全模拟出病毒在人体内的复制过程；④操作复杂、整体费用高；⑤转基因鼠的免疫耐受状态跟人体感染 HBV后的免疫反应过程存在一定差异研究认为，表达特定基因的转基因鼠可用来研究某些特定基因表达产物对 HBV 的影响和潜在的致癌性资料显示在 S 基因过度表达的转基因小鼠中，HBsAg 大量产生，堆积在肝细胞的内质网，对肝脏产生毒性，引起慢性肝损伤、炎症、增生及转录失控，严重的可引起染色体缺失，出现肝癌［14］。

为了探索 X 蛋白在肝癌形成中的潜在作用，制备 HBVx 或 WHVx 基因的转基因鼠，使 X 蛋白过度表达，结果证明 X 蛋白在体内可以促进病毒的复制，6显著提高病毒蛋白的表达，并且肝脏内 X 蛋白表达程度跟肝癌产生存在相关性，这可能是 X 蛋白能削弱 p53 的功能所致［15］为了克服鼠类对 HBV 不易感的缺陷，研究者构建了重组腺病毒和杆状病毒载体，携带具有复制能力的 HBV 基因，转染培养的细胞系或原代肝细胞及给小鼠尾静脉注射，在肝细胞内出现 HBV 复制，并检出 cccDNA，结果显示腺病毒携带外源基因进入肝脏的效率高于杆状病毒，且容易被补体系统灭活，因此，认为杆状病毒不适合用于体基因转移的研究重组腺病毒载体与 HBV 1.3 构建的 Ad HBV 1.3 体系静脉注射小鼠后，在鼠肝细胞内检出 HBV 的复制，但是由于机体的免疫系统作用，致使 HBV 不能长期感染，因此，腺病毒载体构建的病毒感染模型应用受到一定限制［16］采取流体动力学注射法在小鼠尾静脉一次性快速高容量（1.6ml/20g 小鼠）注射质料，可以提高HBV 基因的转染率资料显示，应用流体动力学法同时注射表达 HBV 的质料和针对 HBV 的 siRNA 能够抑制病毒的复制［17］。

认为流体动力学法注射导致 HBV感染的模型可以用作研究抗病毒策略与转基因小鼠相比，该模型有两个优点：①该模型既可用于急性 HBV 感染时机体免疫应答的研究，也可用于抗病毒药物及机体自发清除病毒的机制研究；②该模型还可用研究某些变异的病毒或人工突变的病毒在体内的复制能力 探索嵌合体 HBV 复制治疗的新途径要研究病毒早期感染阶段的机制、cccDNA 的功能、病毒的细胞间扩散感染及病毒清除，就需要能够支持 HBV 感染以及复制的种属特异性肝细胞，由于体外培养的肝细胞内进行研究 HBV 不能完全模拟体内复制并具有其他缺陷等最近研究报道了一些新的模型，将已感染或未感染 HBV 的人肝细胞移植到小鼠体内，作7为研究 HBV 感染的良好体内模型目前研究的主要有三种模型，①三合体小鼠模型：HBV 三合体小鼠（trimera mouse）是由 Tlan 等［18］首次建立的，即通过将感染有 HBV 的人肝脏组织片移植到 Balb/c（已经 SCID 小鼠骨髓细胞重构免。