微生物发酵碳源和氮源.doc

微生物营养要求看，所有微生物都需要碳源，氮源，无机元素，水及生长物质如果是好氧微生物还需要氧气在实验室规模上配制含有纯化合物的培养基非常简单，但在大规模生产上是不合适的第一节工业发酵培养基发酵培养基的作用：-满足菌体的生长-促进产物的形成一、工业上常用的碳源(carbonsource)1. 应用最广的是谷物淀粉(玉米、马铃薯、木薯淀粉)，淀粉水解后得葡萄糖使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：a. 难利用、发酵液比较稠、一般＞2.0%时加入一定的a-淀粉酶b. 成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应2. 葡萄糖-所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标3. 糖蜜制糖工业上的废糖蜜wastemolasses或结晶母液包括：甘蔗糖蜜(canemolasses)糖高，氮少甜菜糖蜜(beetmolasses)两者成分见P226糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，对发酵产生不利的影响，需要进行预处理二、工业上常用的氮源(nitrogensource)1. 无机氮(迅速利用的氮源)种类：氨水、铵盐或硝酸盐、尿素特点：吸收快，但会引起pH值的变化选择合适的无机氮源有两层意义：-满足菌体生长-稳定和调节发酵过程中的pH无机氮源的影响：硫酸铵＞硝酸铵＞硝酸钠＞尿素2. 有机氮：来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。

其中玉米浆(玉米提取淀粉后的副产品)和豆饼粉既能做氮源又能做碳源成分复杂：除提供氮源外，还提供大量的无机盐及生长因子微生物早期容易利用无机氮，中期菌体的代谢酶系已形成——有机氮源有机氮源来源不稳定，成份复杂，所以利用有机氮源时要考虑到原料波动对发酵的影响三、无机盐(inorganicmineral)硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大四、生长因子(growthfactor)微生物生长不可缺少的微量有机物质如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素生长因子不是所有微生物都必需的只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型(biotinauxotroph),以生物素为生长因子1. 生物素作用:(1)主要影响细胞膜通透性P263(2)影响菌体的代谢途径生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累均有影响大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低，即为菌体生长需要的“亚适量”原因：P263,P260(0D值)生物素过量：菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸生物素不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低谷氨酸产生菌为生物素缺陷型。

要达到菌体生长需要的“亚适量”生物素存在于动植物组织中，多与蛋白质呈结合状态存在用酸水解可以分开那么，生产上有哪些原料可以作为生物素来源呢？2. 提供生长因子的农副产品原料(1)玉米浆：(cornsteepliquor,CSL)最具代表性虽然主要用作氮源，但含有乳酸，少量还原糖和多糖，含有丰富的氨基酸，核酸，维生素，无机盐等常作为提供生长因子的物质所以，从某种意义上说，玉米浆液用于配制发酵培养基是发酵工业中的一个重大发现2) 麸皮水解液：可代替玉米浆，但蛋白质，氨基酸等营养成分比玉米浆少3) 糖蜜：两种糖蜜(canemolasses,beetmolasses)均可代替玉米浆但氨基酸等有机氮含量较低4)酵母：可用酵母膏，酵母浸出液或直接用酵母粉第二节淀粉水解糖的制备在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖(glucose)的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖其主要糖分是葡萄糖根据水解条件不同，尚有数量不等的少量麦芽糖及其它一些二糖，低聚糖等复合糖一、淀粉水解制糖的意义1. 大多数微生物不能直接利用淀粉(所有的氨基酸生产菌不能直接利用)2. 有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。

3. 若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增二、淀粉水解糖的制备方法及原理(一)酸解法(acidhydrolysismethod)以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法1. 水解过程：总反应式：(C6H10O5)n+nH2O—nC6H12O6过程：(C6H10O5)n—(C6H10O5)x—C12H22O11—C6H12O6淀粉糊精麦芽糖葡萄糖H+对作用点无选择性，A-1,4-糖苷键和A-1,6-糖苷键均被切断2. 葡萄糖的复合反应和分解反应在水解过程中，由于受到酸和热的作用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应淀粉J盐酸复合反应葡萄糖分解反应//\5‘－羟甲基糠醛有机酸、有色物质<1％复合二糖HJ复合低聚糖损失葡萄糖量7％不利影响：1）降低了葡萄糖的收率2）给产物的提取和糖化液的精制带来困难复合反应：葡萄糖分子间经1，6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味），异麦芽糖和其它低聚糖（复合低聚糖）生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高分解反应：生成的5‘－羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难如何控制分解反应和复合反应的发生？（1）淀粉乳浓度（2）酸浓度都不能过高原因P229-230（3）温度3. 评价优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。

缺点：（1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值（葡萄糖值）只有90%左右2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉DE值：dextroseequivalentvalue（葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量还原糖含量（%）DE值=x100%干物质含量（%）P231（中间）图最高点下降的原因？（二）酶解法（enzymehydrolysismethod）用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺分两步：（1）液化：用A-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精和低聚糖转化为葡萄糖所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法（doubleenzymehydrolysismethod）液化（liquification）a—淀粉酶水解底物内部的a—1,4糖苷键，不能水解a—1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快85—90^0淀粉的糊化与老化：由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力非常强，需要先加热淀粉乳，使淀粉颗粒吸水膨胀，糊化，破坏结晶性结构0糊化：淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象0老化：指分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程0▲淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，必须采取相应的措施控制糊化淀粉的老化。

液化程度的控制（液化后需糖化的原因）：如果让液化持续下去，虽然最终产物也是葡萄糖和麦芽糖，但：a. 糖液的DE值低（a-淀粉酶不能水解a-1,6糖苷键）b. 液化在较高温度下进行，液化时间加长，一部分已液化的淀粉又会重新结合成硬束状态，老化，使糖化酶难以作用c. 液化的目的是为了给糖化酶的作用创造条件，而糖化酶水解糊精及低聚糖等分子时，需先与底物分子生成络合结构，然后发生水解作用，这就要求被作用的底物分子有一定的大小范围才有利于糖化酶生成这种结构，底物分子过大或过小都会妨碍酶的结合和水解速度根据生产经验，DE值在20-30之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色P25液化到终点后，为了避免液化酶对糖化酶的影响，需对液化液进行灭酶处理，升温到100°C,保持10分钟，降温，供糖化用2. 糖化（saccharification）糖化酶从非还原性末端水解a-1,4糖苷键和a-1,6糖苷键终点确定：DE值达最高时（DE值不再上升时），停止酶反应（加热至80C,20min灭酶）否则DE值将由于葡萄糖经a-1,6糖苷键起复合反应而降低糖化的温度（50-60C）和pH值（4.0-5.0）决定于所用糖化剂的性质。

3. 评价优点：（1）反应条件温和，不需高温、高压设备2）副反应少，水解糖液纯度高3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解4）糖液颜色浅，质量高缺点：（1）生产周期长，一般需要48小时2）需要更多的设备，且操作严格三）酸酶结合法（acid-enzymehydrolysismethod）集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺根据原料淀粉性质分：1. 酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底€适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用-淀粉酶液化，再用酸水解€2.酶酸法：先用适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀或者小的水解，大的未水解；或者大的水解，时间长，小的则发生复合反应四）不同糖化工艺的比较项目酸解法酸酶结合法酶解法DE值919598羟甲基糠醛（％）0.30.0080.003色度100.30.2淀粉转化率909598工艺条件高温加压高温加压常温过程耗能多多少副产物多中少生产周期短中长设备规模小中大防腐要求高较高低适合发酵工艺情况差中有利第三节糖蜜原料糖蜜是很好的发酵原料，用其生产，可降低成本，节约能源，便于实现高糖发酵工艺，但有些成分不适合发酵，必须进行预处理。

一、糖蜜的分类及组成含糖量含氮量1.分类：canemolasses高低beetmolasses低高rawsugarmolasses精制粗糖时分离出的糖蜜hightestmolasses（高级糖蜜）glucosemolasses葡萄糖工业不能再结晶葡萄糖的母液2. 组成：粘稠、黑褐色、半流动状液体组成各不相同除含有发酵性糖分外，还含有胶体物质，灰分，维生素，氨基酸甘蔗糖蜜中生物素含量较甜菜糖蜜中高国外大多以糖蜜为原料生产谷氨酸二、糖蜜的预处理：胶体（产生大量泡沫）和灰分影响菌体生长及产品纯度1.澄清：加酸，加絮凝剂（石灰）2. 脱钙：加Na2CO33. 降低生物素含量（谷氨酸发酵中）（1）去除生物素：活性炭及树脂吸附（2）拮抗生物素：加表面活性剂（Tween60）,阻止油酸合成—磷脂合成不足3）加青霉素：使新增殖的子细胞不具有完整的细胞壁，改善了细胞膜的渗透性另外，从菌种方面：使用油酸或甘油缺陷型，不受培养基中高生物素的影响微生物发酵生长因子（图）生长因子（growthfactor）是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物它的需要量一般很少广义的生长因子除了维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4〜C6的分枝或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸；而狭义的生长因子一般仅指维生素。

生长因子虽是一种重要的营养要素，但它与碳源、氮源和能源不同，并非任何一种微生物都须从外界吸收的各种微生物与生长因子的关系可分以下几类：（1）生长因子自养型微生物（auxoautotrophs）多数真菌、放线菌和不少细菌，如E.coli（大肠杆菌）等都是不需要外界提。