蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵液冻乾粉之大鼠28天重复剂量亚急.pdf

1檢驗及品保雜誌 (J Testing Qual Assur) 2016; 5:79~???蝙蝠蛾擬青黴菌絲體發酵液凍乾粉之大鼠 28 天重複劑量亞急性毒性評估盛莉莎1，葉淑幸1，方惟正1，陳彥博1，江逸敏1，蔡岳廷2，陳勁初1，3~7*葡萄王生技股份有限公司，桃園市1；台美檢驗科技有限公司，新北市2；新竹教育大學應用科學系，新竹市3；台灣大學食品科技研究所，台北市4；實踐大學食品營養與保健生技學系5，台北市5；中原大學生物技術系，桃園市6；彰化師範大生物技術研究所，彰化市7，台灣摘要蝙蝠蛾擬青黴是分離自冬蟲夏草的一無性菌株，本試驗依衛福部公告之健康食品安全性評估方法，測試蝙蝠蛾擬青黴（學名：Paecilomyces hepiali）菌絲體發酵液凍乾粉餵食大鼠 28 天後，對體內可能產生之 毒性本試驗共設 4 組試驗組，分為對照組、低、中及高劑量組其每日投予劑量分別為低劑量組 1 g/kg B.W.、中劑量組 2 g/kg B.W.及高劑量組 5 g/kg B.W.每組使用雄性及雌性之Sprague-Dawley (SD)品系大鼠各 10 隻，以口服管餵方式投予蝙蝠蛾擬青黴菌絲體發酵液凍乾粉連續經過 28 天，對於試驗動物每日進行臨床觀察，並每週測量體重和攝食量。

試驗結束後，犧牲大鼠採集臟器及血液做血液學分析、血清生化分析及病理學檢查結果顯示，試驗期間所有實驗大鼠均無出現異常的臨床症狀，體重均能正常增重，眼 睛檢查也無異常綜合以上實驗結果，蝙蝠蛾擬青黴菌絲體發酵液凍乾粉對大鼠 28 天重複劑量亞急性毒性試驗之無毒性顯示之劑量(no-observed-adverse-effect level, NOAEL)為大於 5 g/kg B.W.關鍵字：蝙蝠蛾擬青黴菌絲體粉、冬蟲夏草、28 天重複劑量亞急性毒性試驗前言冬蟲夏草為名貴中藥材，具有補虛損、益精氣、止血化痰、對虛喘癆咳、盜汗、抗衰老、免疫調節[1]等均有療效[2, 3]近年來，由於生長環境要求嚴苛及因暴利和需求量增加，對天然蟲草的過度挖掘導致野生蟲草的產量越來越少，發生供不應求的趨勢，因此希望分離出其中的菌種用人工發酵生產其替代品，以解決目前的問題，蝙蝠蛾擬青黴(Paecilomyces hepiali)是從冬蟲夏草中分離得到的伴生菌株，在中國被列為可用於保健食品的真菌菌種名單中，並有研究顯示蝙蝠蛾擬青黴製成的產品可用於治療高脂血症、慢性支氣管炎及男性性功能失調等病症，均有一定改善效果[4]中國中醫研究院中藥研究所於 1982 年採集分離出其伴生菌株[5]，並經過菌種研究鑒定 後 定 名 為 蝙 蝠 蛾 擬 青 黴 (Paecilomyceshepiali)，屬於叢梗孢科(Moniliaceae)擬青黴菌屬(Paecilomyces)。

之後中國醫學科學院藥物所採集新鮮冬蟲夏草分離得到的蟲草菌Cs-4 菌株，經鑑定也是蝙蝠蛾擬青黴該菌經發酵所得菌絲與天然蟲草化學成分比對分析研究證實，兩者主要成分、藥理作用基本相似，臨床試驗證明其對人體的功效有護腎*通訊地址：葡萄王生技股份有限公司 陳勁初桃園縣中壢市龍岡路三段 60 號電話：(03) 4572121 ext. 234Email:gkbioeng@.tw蝙蝠蛾擬青黴菌絲體發酵液凍乾粉之大鼠 28 天重複劑量亞急性毒性評估22益肺[6]、抑菌[7]、降血脂[8]、促進免疫調節[9]等功效在菌絲體發酵成分分析中知含有D-甘露醇、腺苷、麥角甾類、多醣等[10]為了開發天然冬蟲夏草在製藥業和食品工業上的替代品，了解蝙蝠蛾擬青黴菌絲體的安全性，在中國大陸山東省疾病預防控制中心對其食用安全性試驗也有相關研究，結果顯示蝙蝠蛾擬青黴菌絲體粉在試驗期間內的各項指標均未見明顯毒性反應，由此認定其作為保健食品的安全性[11]雖然在中國，蝙蝠蛾擬青黴發酵菌絲膠囊已販售二十餘年，但不同的發酵條件及菌株其發酵凍乾粉的成分可能並不一致，因此完成蝙蝠蛾擬青黴菌絲體發酵液的三項基因毒性試驗（沙門氏菌回復突變試驗、體外哺乳類細胞染色體結構異常試驗及齧齒類週邊血液微核試驗）證實無基因毒性後[6]，接著探討大鼠 28 天重複劑量亞急性毒性試驗，以作為人體食用安全性之參考。

材料與方法樣品製備從新鮮的冬蟲夏草子實體中進行菌種分離純化培養，挑選出不產生孢子，白色菌絲菌落，委託財團法人食品工業發展研究所生資中心（Bioresource collection and researchcenter, BCRC, Food Industry Research andDevelopment Institute, FIRDI，新竹市，台灣）依其菌株培養形態學、顯微構造及rDNAITS1-5.8S-ITS2 片段定序進行鑑定而確認為蝙蝠蛾擬青黴(Paecilomyces hepiali)菌種將鑑定後的菌株在發酵槽進行液態培養其生產流程是由三角瓶液體培養基接種，培養五到七天後，接入 200L發酵槽進行液態發酵，七天後再經由接種管路打入 20 噸發酵槽進行放大培養其發酵條件需控制溫度在17~25℃，轉速 50~120 rpm/min，起始pH為5.0~7.5，及較高的通氣量，培養 5~7 天後於100℃加熱 1hr後收槽先將發酵液離心留下菌體，濾液則進一步濃縮，再混合菌體進行乾燥，磨粉製成發酵全液粉末實驗動物Sprague-Dawley (SD)品系大鼠係購自樂斯科生物科技股份有限公司（BioLASCO Ta-iwan Co., Ltd，宜蘭縣，台灣）共計雄性 40隻、雌性 40 隻，試驗開始為 8~9 週齡，飼養於通過 TFDA-GLP 與 OECD-GLP 認證的台美檢驗科技有限公司動物房。

飼養環境為 22± 3℃、相對濕度 55 ± 15%、照明 12 小時、換氣頻率每小時 10-15 次的動物房飼養方式為雌雄大鼠分開飼養，每籠兩隻，飼養於經高溫高壓滅菌後之塑膠製飼育籠飼料使用 MFG (Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo,Japan)飲水係經高溫高壓滅菌之逆滲透水以水瓶方式供應試驗依據大鼠體重進行排序及隨機分組，而每隻大鼠以打耳洞的方式作為識別方法，各動物組別的飼育籠均貼上實驗動物標示卡，分別記載動物來源、品系、性別、試驗編號、試驗期間等試驗物質投予方式是以塑膠針筒套上餵食針（16 gauge，80 mm 長）進行管餵檢測項目試驗期間每日進行臨床觀察，並記錄投予試驗物質後試驗大鼠是否出現異常之臨床症狀或死亡情形在投予前及試驗期間每週量測一次體重，而攝食量則用每週給予定量飼料的消耗量計算，一週結算一次動物經隔夜禁食，在試驗結束當天以二氧化碳麻醉後經心臟進行血液採樣，繼而安樂死採樣的血液有一部分置於含 EDTA 抗凝血管中混合均勻，以自動血球分析儀(XT-1800, Sysmex,Canada)進行檢測另一部分血液樣品則靜置於室溫待其凝固後，離心分離出血清，並以血清生化分析儀(7070 Autoanalyzer, Hitachi,盛莉莎葉淑幸方惟正陳彥博江逸敏蔡岳廷陳勁初33Japan)進行檢測。

在對安樂死的試驗動物進行屍體解剖時，以肉眼觀察外觀、口腔、顱腔及體內所有組織器官，繼而採取各組動物的腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、腎上腺、睪丸或卵巢等組織，保存於 10 %中性福馬林緩衝固定液，其中睪丸需以 modified Davidson’s solution 固定 24 小時後，再放置於 10 %中性福馬林溶液保存[12]取下的主要器官在去除週邊脂肪組織後，分別秤重、以計算臟器相對重量比率(%) （臟器重量/體重x100%）將對照組和高劑量組大鼠臟器進行組織病理切片檢查，完成福馬林溶液固定之器官，經脫水、澄清、石蠟浸潤及包埋等處理程序，製成石蠟組織塊，再以石蠟組織切片機(RM 2145, Leica)切成 2 μm 厚度之組織切片，以Hematoxylin15:7-12.圖 3.蝙蝠蛾擬青黴菌絲體發酵液凍乾粉進行 28 天亞急毒性試驗時在對照組及高劑量組之臟 器的組織病理觀察圖中指出組織病理觀察結果皆顯示無明顯組織病理變化〔以 Hemotoxylin31:1974-63.傅惠英，張利棕，壽旗揚 中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉小鼠免疫功能調節作用的比較中國比較醫學雜誌 2012; 22:16-20。

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