
双缩脲法测定蛋白质含量.docx
3页实验二十 蛋白质含量测定一一双缩脲法测定蛋白质含量一、 实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法二、 实验原理在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红 色的络合物,这一反应称双缩脲反应凡分子中含二个或二个以上酰胺基(一 CO-NH2),或与此相似的基团[如一CH2-NH2, —CS-NH2, —C(NH)NH2]的任何 化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上 述反应蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强 度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含 量测定范围为1〜10mg蛋白质干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少 主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲法常用于快速,但并不需要十分精确的蛋白 质测定三、 实验试剂和器材[试剂]1. 双缩脲试剂:取CuSO4 - 5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量 蒸馏水溶解,再加2.5mol / L NaOH溶液300ml,KI 1.0g,然后加水至1000ml。
棕色瓶中避光保存长期放置后若有暗红色沉淀出现,即不能使用2. 标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA )或标准酪蛋白, 配制成10g/L的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯 度如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出 其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液牛血清清蛋白用H2O或 0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制[器材]1. 试管:15 X 150mm试管7只;2. 1ml, 5ml 移液管;3. 坐标纸;4. 721分光光度计四、实验操作取试管7支,编号,按下表操作:试剂(ml)\管号空白管12345测定管蛋白标准液(10g/L)-0.10.20.30.40.5-生理盐水0.50.40.30.20.1-0.4待测样品------0.1双缩脲试 剂3.03.03.03.03.03.03.0相当蛋白 质(g/L)01020304050-混匀,37°C水浴20分钟,冷却至室温,在分光光度计波长540nm处,用空 白管调零,读取各管吸光度值1〜5为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度 为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
以测定管的吸光度,在标准曲线 上求得蛋白质浓度[注意事项]1. 双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2+形成稳定的络合铜离子,以防止CuSO4 - 5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀 酒石酸钾钠与CuSO4 - 5H20之比不低于3 : 1,加入KI作为抗氧化试剂2. 双缩脲试剂要封闭贮存,防止吸收空气中的二氧化碳3. 本法各种蛋白质的显色程度基本相同,重复性好,几乎不受温度影响, 唯一缺点是灵敏度较低4. 黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰[思考题]1. 双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量?2. 请用双缩脲法,设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。












