双缩脲法测定蛋白质含量.docx

实验二十 蛋白质含量测定一一双缩脲法测定蛋白质含量一、 实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法二、 实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红 色的络合物，这一反应称双缩脲反应凡分子中含二个或二个以上酰胺基(一 CO-NH2)，或与此相似的基团［如一CH2-NH2, —CS-NH2, —C(NH)NH2］的任何 化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上 述反应蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应，且呈色强 度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含 量测定范围为1〜10mg蛋白质干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少 主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白 质测定三、 实验试剂和器材［试剂］1. 双缩脲试剂：取CuSO4 - 5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量 蒸馏水溶解，再加2.5mol / L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。

棕色瓶中避光保存长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA )或标准酪蛋白， 配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯 度如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出 其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液牛血清清蛋白用H2O或 0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制［器材］1. 试管：15 X 150mm试管7只;2. 1ml, 5ml 移液管;3. 坐标纸；4. 721分光光度计四、实验操作取试管7支，编号，按下表操作:试剂(ml)\管号空白管12345测定管蛋白标准液(10g/L)-0.10.20.30.40.5-生理盐水0.50.40.30.20.1-0.4待测样品------0.1双缩脲试 剂3.03.03.03.03.03.03.0相当蛋白 质(g/L)01020304050-混匀，37°C水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空 白管调零，读取各管吸光度值1〜5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

以测定管的吸光度，在标准曲线 上求得蛋白质浓度［注意事项］1. 双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO4 - 5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀 酒石酸钾钠与CuSO4 - 5H20之比不低于3 : 1，加入KI作为抗氧化试剂2. 双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳3. 本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响， 唯一缺点是灵敏度较低4. 黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰［思考题］1. 双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量?2. 请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。