(可用来交论文)生命科学进展综述——反义RNA技术与RNA干扰技术.doc

反义RNA技术与RNA干扰技术　摘要：RNA 是生物体内最重要的物质基础之一,它与DNA 和蛋白质一起构成了生命的框架因其能干涉哺乳动物基因表达而颇受瞩目,并且由此而引发的RNA 干涉( RNAi)成为了当前分子生物学和细胞生物学最为热门的话题之一RNA干扰技术在2002年被Science杂志评为年度十大科技成就之首，而反义RNA 技术的发现对现代医疗技术的发展也起着重要的作用.常规的反义RNA 技术是设计出与靶RNA 互补的寡核苷酸,通过它与靶RNA 结合来干扰转录或翻译过程,使蛋白质不能被表达出来本文通过对热点的RNA干扰技术以及反义RNA技术的生物学特性，分子机制，产生方法，和应用以及展望等方面的介绍，在对比中得出该两种技术的异同点，从而使对以RNA干扰和反义RNA为代表的RNA技术有更深入的了解关键词：反义RNA技术， RNA干扰技术，生物学特性，分子机制，产生方法，应用,展望Antisence RNA Technique and RNAi TechniqueAbstract：RNA is one of the most essential fundamental substances, together with DNA and protein; it forms the frame of life. RNA has been much fixed eye on by the reason that it can interfere in the gene expression of mammals, which leads the RNAi to be one of the most heated topics in molecular biology and cytobiolog. With the RNAi technique regarded the first of the top 10 science and technology achievements by Science, the discovery of antisence RNA technique plays an irreplaceable role in the development of medical techniques. The regular antisence RNA technique designs the oligonucleotide which causes a complementation with the target RNA, by its combination with target RNA, it interferes the translation of transcription and translation, thus making it incapable for protein to express. This article introduces the biological characteristics, molecule mechanisms, preparation, application and future of both the antisence RNA technique and RNAi technique. With the contradistinction of these two techniques, we can get a better and comprehensive understanding of them.Key word: antisence RNA technique; RNAi technique; biological characteristics; molecule mechanisms; preparation; application; future1．概念1．1 反义RNA技术：反义RNA（antisence RNA）是一种与特异的mRNA互补的RNA分子，它通过配对碱基间氢键作用于对相应的RNA而形成双键复合物（即反义RNA：mRNA二聚合体），抑制RNA的翻译过程。

而反义RNA技术是指，利用人工合成或生物体合成特定互补RNA片段或其化学修饰产物来抑制或封闭基因表达的技术1．2 RNA干扰技术：RNA干扰（RNAinference, RNAi）是指双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的诱导与之同源互补的mRNA降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象2．机理2．1 反义RNA抑制基因表达机理无论是真核细胞还是原核细胞，均含有反义RNA许多实验证明, 病毒和细菌中反义RNA的调节或抑制基因活性是普遍存在的迄今在原核生物中发现的反义RNA共11种，其中9种作用在翻译水平，1种在转录水平，1种在复制前水平[1]而真核生物中也发现有自然存在的反义RNA, 并有将人工构建的反义RNA注入细胞进行基因调控成功的报道例如, 向脊椎动物细胞内输入肌动蛋白的反义RNA表达质粒, 可以明显抑制肌动蛋白基因的表达, 进而使细胞形态发生改变又如, 1990年国内报道, 反义C一Ha一ras 寡聚核等酸可以干扰C一Ha一ras 癌基因的表达, 抑制P21蛋白合成等反义RNA 被认为是一种基因表达的抑制因子它在复制水平、转录水平和翻译水平上都能对相关基因的表达进行调控[2]，其作用方式主要表现在以下几个方面:2．1．1 在DNA复制水平的调控ColE1 等其他有关质粒复制的前提条件是合成适当的RNA 引物(RNAII) ,它可以折叠形成一定的构象,与模板DNA 恰当地结合。

而反义RNA(RNAI) 在一些蛋白质分子作用下,与RNAII 及其前体配对,不但阻止了RNAII与DNA 模板间的变性,而且还抑制了RNaseH 对RNAII 前体的加工,因此无法产生合适的引物,使ColE1 的复制受到抑制2．1．2 在转录水平的调控Okamoto 和Freundlich 认为, tic RNA 结合于crp mR2NA 的5′端,这种分子间形成的结构,类似于RNA 聚合酶识别的转录终止信号的二级结构在此,反义RNA 的作用方式与衰减子的作用方式相似,以反式作用对转录过程本身进行调控2．1．3 在翻译水平上的调控mic F、sar 及IS10 的反义RNA 可以结合于靶mRNA的SD 序列及编码区,从而抑制核糖体与mRNA 的结合,直接参与翻译水平的调控近来,Malmgren 等的研究结果也显示,在质粒R1 中,虽然反义RNA、CopA 并不能与repAmRNA 在SD 序列完全配对,但二者之间同样能形成吻触复合体(kissing complex) ,阻止核糖体在此处的结合[3 ] 另一方面, Krink 和Wulff (1987) 通过研究oop RNA 对cII 基因的调控推测, 反义RNA 与靶RNA 互补区段结合, 形成RNA :RNA 双链结构,RNaseIII 可以特异性地对其识别,并将二者剪切掉,这种间接调控影响了翻译的进行。

2．2 RNAi的生物学特性和作用特点2．2．1 RNAi具有以下几个重要的生物学特性: ① RNAi是SiRNA介导的转录后水平的基因沉默,目前认为它对染色体DNA的复制和转录过程没有影响② 高度特异性: RNA只引起与dsRNA 同源的mRNA 降解, 并不影响其他基因mRNA 的表达[4]③ 高效性:相对少量的dsRNA就能有效抑制靶基因的表达,这表明dsRNA介导的RNAi是以催化放大的方式进行的,因此dsRNA的抑制作用要比反义RNA的抑制作用高出上十倍④ 种属时效性: RNAi效应在低等生物中可以持续存在,但在哺乳动物细胞中只能维持一段时间,一般在注入dsRNA后的2 ～3 h作用最明显,持续2 ～3 d⑤ 传播性和遗传性: RNAi效应可以突破细胞界限,在不同细胞甚至生物体间长距离传递, 并且可以传递给子代[ 5 - 7 ] 2．2．2 RNAi与转录后水平的基因沉默( PTGS) 、共抑制( cossupp ression) 、基因压制( quelling)的关系上述几个概念之间有着密切的关系：PTGS是指内源性基因在“异常RNA”( aberrant RNA)的诱导下发生基因沉默的调控过程。

被抑制的基因能够正常转录, 但转录后的mRNA 产物会被迅速的降解掉而无法积累和发挥功能,所以属于转录后水平的基因沉默机制共抑制是指内源性基因在转基因或病毒感染的诱导下发生的基因沉默现象,大部分是转录后水平的基因沉默,但在一些植物中转基因诱导基因功能的抑制涉及基因特异性甲基化过程,所以它也可以是转录水平的基因沉默基因压制是指存在于真菌中由转基因诱导的抑制转基因自身和相应内源基因表达的转录后水平基因沉默现象[5]经过多年的研究, 目前人们普遍认为RNAi、PTGS、cossuppression、quelling都属于转录后水平的基因沉默过程,并且可能具有相同的分子机制2．2．3 RNAi的分子机制迄今关于RNAi的分子机制主要有两种理论其一是“随机降解PCR 模式”, 其二是“核酸内切酶的切割模式”[8] 随机降解PCR模式是以SiRNA作为引物,让它与互补的靶mRNA相结合,在RNA依赖的RNA多聚酶(RdRp )作用下,以靶mRNA为模板合成1个cRNA与靶mRNA杂合的双链RNA,然后这个cRNA /mRNA双链RNA被Dicer酶降解,导致靶mRNA的降解,同时又可以产生新的SiRNA。

核酸内切酶的切割模式则认为长序列的dsRNA导入细胞后,被剪切成长度约21～25个核苷酸的双链小分子RNA片段( SiRNA) , SiRNA作为引导RNA ( gRNA)与蛋白复合物相结合,形成一种RNA诱导的基因沉默复合体(R ISC) 在ATP的参与下,活化的R ISC识别与SiRNA具有同源互补序列的靶RNA,对其进行切割,产生RNAi效应[ 9-10 ]2．2．4　非特异性干涉现象科研人员在对哺乳动物RNAi的研究中发现转染的长链dsRNA超过30 nt就会引起非特异性的蛋白质合成抑制和mRNA降解,而并不是人们所希望得到的特异性基因表达抑制这种非特异性抑制过程是宿主细胞对于应激或病毒感染的一种防御性反应,即干扰素反应其原因可涉及两个方面,其一是长链dsRNA激活dsRNA依赖性蛋白激酶PKR,活化的PKR可以使翻译起始因子e IF2α的小亚基磷酸化失活,从而全面阻断蛋白质的翻译过程其二是PKR被dsR2NA激活后,还可以使2′, 5′多聚腺苷酸磷酸化,从而激活非特异性的RNasel,降解RNA [ 5,11 ]3．获得的制备方法以及实验方法3．1反义RNA制备3．1．1 利用诱导剂诱导合成 既然原核真核生物中均存在反义RNA, 说明生物体存在有指导反义RNA合成的基因, 可通过寻找适当诱导剂使该基因开放、激活, 从而获得相应的反义RNA。

3．1．2 采用重组DNA技术构建反义表达载体 首先分离相应的mRNA, 以mRNA为模板合成互补DNA, 再以该DNA链为模板合成有意义DNA链, 形成双链DNA分子, 将双链DNA分子反向拼接于质粒中形成反义表达载体, 转录时表达载体将合成反义RNA图1：反义RNA表达载体的构建Fig.1: The Construction of the Expression Carrier of Antisence RNA3．1．3 利用Qβ复制酶技术扩增 利用Qβ噬菌体的变体MDV-I（具有RNA复制酶的识别和起始序列）。