第三节沉淀试验.docx

第十一章血清学试验 第三节沉淀试验 一、沉淀试验的概念 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、 血清、组织浸出液等）与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间， 形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitation reaction test ） 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素二、沉淀试验的类型沉淀试验可分为液相沉淀试验和 固相沉淀试验，液相沉淀试验有环状沉淀试验和絮状沉淀试验，以前者应用较多；固 相沉淀试验有琼脂凝胶扩散试验和免疫电泳技术一） 环状沉淀试验（ring precipitation test）是一种在两种液体界面上进行 的试验，是最简单、最古老的一种沉淀试验，目前仍广泛应用方法为在小口径试管 中加入已知沉淀素血清，然后小心沿管壁加入等量待检抗原于血清表面，使之成为分 界清晰的两层数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应试验 中要设阴性、阳性对照本法主要用于抗原的定性试验，如 诊断炭疽的Ascoli试验、 链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定等二） 琼脂凝胶扩散试验 简称琼扩，反应在琼脂凝胶中进行琼脂是一种 含 有硫酸基的酸性多糖体，高温98C时能溶于水，冷却凝固（45C时）后形成凝胶，琼 脂凝胶是一种多孔的网状结构。

1%琼脂凝胶的孔径约为85nm因为凝胶网孔中充满水 分，小于孔径的抗原或抗体分子可在琼脂凝胶中自由扩散，由近及远形成浓度梯度， 当二者在比例适当处相遇时，即可发生沉淀反应，因形成的抗原 抗体复合物为大于 凝胶孔径的颗粒，不能在凝胶中再扩散，就在凝胶中形成肉眼 可见的沉淀带，称此 试验为琼脂凝胶扩散试验琼脂扩散可分单扩散和双扩散单扩散是抗原抗体中一种成分扩散，另一种成 分均匀分布于凝固的琼脂凝胶中；而双扩散则是两种成分在凝胶内彼此都扩 散；根据 扩散的方向不同又分为单向扩散和双向扩散向一个方向直线扩散者称为单向扩散， 向四周辐射扩散者，称为双向扩散故琼脂扩散可分为单向单扩散、单向双扩散、 双向单扩散和双向双扩散四种类型其中以双向双扩散应用最广泛1. 双向单扩散又称辐射扩散，试验在玻璃板或平皿上进行，用1.6%〜2.0%琼脂加一定浓度的等量抗血清浇成琼脂凝胶板， 厚度为2〜3mm在其上打直径为2mr的小孔，孑L内滴加相应抗原液，放入密闭湿盒中扩散24〜48h抗原在孔内向四 周辐射扩散，在比例适当处与凝胶中的抗体结合形成白色沉淀环此白色沉淀 环的 大小随扩散时间的延长而增大，直至平衡为止沉淀环面积与抗原浓度成正比，因 此可用已知浓度抗原制成标准曲线，即可用以测定抗原的量。

此法在兽医临床已广泛用于传染病的诊断，如鸡马立克氏病的诊断即将马立 克氏病高免血清浇成血清琼脂平板，拔取病鸡新换的羽毛数根，自毛根尖端1cm处 剪下插入琼脂凝胶板上，阳性者毛囊中病毒抗原向周围扩散，形成白色沉淀环2. 双向双扩散此法以1%K脂浇成厚2〜3mr的凝胶板，在其上按设计图形打圆孔 或长方形槽，封底后在相邻孔（槽）内滴加抗原和抗体，饱和湿度下扩散24〜96h, 观察沉淀带（彩图4）抗原抗体在琼脂凝胶中相向扩散，在两孔间比例最适的位置 上形成沉淀带，如抗原抗体的浓度基本平衡时，沉淀带的位置主要决定于两者的扩散 系数但若抗原过多，则沉淀带向抗体孔增厚或偏移；若抗体过多，则沉淀带向抗原 孔偏移双扩散主要用于抗原的比较和鉴定，两个相邻的抗原孔（槽）与其相对的抗体孔 之间，各自形成自己的沉淀带此沉淀带一经形成，就象一道特异性屏障一样，继续 扩散而来的相同抗原抗体，只能使沉淀带加浓加厚，而不能再向外扩散，但对其他抗 原抗体系统则无屏障作用，它们可以继续扩散沉淀带的基本形式有以下三种两相 邻孔为同一抗原时，两条沉淀带完全融合，如二者在分子结构上有 部分相同抗原决定 簇，则两条沉淀带不完全融合并出现一个叉角。

两种完全不同的抗原，则形成两条交 叉的沉淀带不同分子的抗原抗体系统可各自形成两条或更多的沉淀带图11-3）双扩散也可用于抗体的检测，测抗体时，加待检血清的相邻孔应加入标准阳性血 清作为对照，以资比较测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大 稀释度为抗体效价，（图11-4）目前此法在兽医临床上广泛用于细菌、病毒的鉴定和传染病的诊断如检测马传 贫、口蹄疫、禽白血病、马立克氏病、禽流感、传染性法氏囊病的琼脂扩散方法，已 列入国家的检疫规程，成为上述几种疾病的重要检疫方法之一三）免疫电泳 免疫电泳技术是把凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测 技术即将琼脂扩散置于直流电场中进行，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其 扩散方向，在比例合适处形成可见的沉淀带此技术在琼脂扩散的基础上，提高了反应 速度、反应灵敏度和分辨率在临床上应用比较广泛的有对流免疫电泳和火箭免疫电 泳等1.对流免疫电泳 是将双向双扩散与电泳技术相结合的免疫检测技术大部分抗 原在碱性溶液（pH>8.2）中带负电荷，在电场中向正极移动；而抗体球蛋白带电荷弱， 在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极移动如果将抗体置 于正极端，抗原置 负极端，则电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间形成沉淀带（图 11-5）。

试验时，首先制备琼脂凝胶板（免疫电泳需选用优质琼脂或琼脂糖），以pH8.2 〜8.6的巴比妥缓冲液制备1%〜2%琼脂，浇注凝胶板，厚约4mm待其凝固后，在琼 脂凝胶板上打孔，挑去孔内琼脂后，将抗原置负极一侧孔内，抗血清置 正极一侧孔 加样后电泳30〜90min，观察结果沉淀带出现的位置与抗原抗体含量和泳动速度相 关如果抗原抗体含量相当，沉淀带在两孔间呈一条直线；若 二者含量和泳动速度差 异较大，沉淀带出现在对应孔附近，呈月牙形；如果抗原 或抗体含量过高，可使沉淀 带溶解有时抗原量极微，沉淀带不明显，在这种情况下，可把它在37C中保温数小 时，以增加清晰度对流免疫电泳比双向双扩散敏感10〜16倍，并大大缩短了沉淀带出现的时间，简 易快速，现已用于多种传染病的快速诊断如口蹄疫、猪传染性水疱病等 病毒病的诊断2.火箭免疫电泳 是将辐射扩散与电泳技术相结合的一项检测技术，简称火箭电 泳将pH8.2〜8.6的巴比妥缓冲液琼脂融化后，冷至56c左右，加入一定量的已知抗 血清，浇成含有抗体的琼脂凝胶板在板的负极端打一列孔，孔径3mm孔距8mm滴 加待检抗原和已知抗原，电泳2〜10h电泳时，抗原在含抗血清的凝胶板中向正极迁 移，其前锋与抗体接触，形成火箭状沉淀弧，随抗原继续向前移动，此火箭状锋亦不 断向前推移，原来的沉淀弧由于抗原过量而重新溶解。

最后抗原抗体达到平衡时，即形成稳定的火箭状沉淀弧 （图11-6）在试验中由于抗体浓度保持不变，因而火箭沉淀弧的高度与抗原浓度呈正比，本法多用于检测抗原 的量（用已知浓度抗原作对比）。