酶促反应动力学王镜岩生物化学全课件.ppt

第第1010章章 酶促反应动力学酶促反应动力学 影响酶促反应速度的因素影响酶促反应速度的因素kinetics of enzyme—catalyzed reactions 酶促反应的动力学酶促反应的动力学酶促反应速度的测定与酶的活力单位酶促反应速度的测定与酶的活力单位反应时间反应时间产产物物浓浓度度1 酶促反应速度的测定酶促反应速度的测定2 酶活力的测定酶活力的测定酶活力的表示方法酶活力的表示方法酶的活力单位酶的活力单位习惯单位：某酶在最适条件下，单习惯单位：某酶在最适条件下，单位时间内位时间内 一定底物的减少或产物的一定底物的减少或产物的生成所需的酶量生成所需的酶量国际单位国际单位（（IU）：在标准条件下，）：在标准条件下，一分钟内催化一分钟内催化1umol底物转化的酶底物转化的酶量为一个酶活力单位量为一个酶活力单位Kat单位：在一定条件下，每单位：在一定条件下，每秒钟转化秒钟转化1mol底物所需的酶量底物所需的酶量酶的比活力酶的比活力每毫克蛋白所含酶的活力单位数每毫克蛋白所含酶的活力单位数（常常作为酶制剂纯度的指标）（常常作为酶制剂纯度的指标）酶的转换数酶的转换数（（Kcat））每秒钟、每个酶分子转换底物的每秒钟、每个酶分子转换底物的umol数数影响酶反应速度的因素影响酶反应速度的因素2、底物浓度、底物浓度3、、pH （最适（最适 pH的概念）的概念）4、、 温度温度 （最适温度的概念）（最适温度的概念）5、激活剂、激活剂6、抑制剂、抑制剂1、酶浓度、酶浓度当当S足够过量，其它条件固定且无足够过量，其它条件固定且无不利因素时，不利因素时，v=k[E]二、底物浓度对酶反应速度的影响二、底物浓度对酶反应速度的影响1、酶反应速度与底物浓度的关系曲线、酶反应速度与底物浓度的关系曲线 （（Michaelis—Menten曲线）曲线）2、米氏方程的提出及推导、米氏方程的提出及推导3、米氏常数的意义、米氏常数的意义4、米氏常数的测定、米氏常数的测定1、酶反应速度与底物浓度的关系曲线、酶反应速度与底物浓度的关系曲线酶促反应速度的测定酶促反应速度的测定反应时间反应时间产物产物浓度浓度底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响一级反应一级反应混合级反应混合级反应零级反应零级反应[S]VVmax1/2VmaxKm酶促反应速度与底物浓度的关系酶促反应速度与底物浓度的关系（（Michaelis-Menten曲线）曲线）1、、当底物浓度当底物浓度较低时，表现为较低时，表现为一级反应一级反应（（v=dc/dt=kc v=dc/dt=kc 线性关系）线性关系）2 2、随着底物浓、随着底物浓度的增加，反应度的增加，反应表现为表现为混合级反混合级反应。

应3 3、当底物浓度、当底物浓度达到相当高时，达到相当高时，表现为表现为零级反应零级反应（与底物浓度无（与底物浓度无关） •根据以上实验结果，根据以上实验结果，HenriHenri和和WurtzWurtz提提出了出了酶底物中间络合物学说酶底物中间络合物学说即酶和底物形成中间复合物的学说已酶和底物形成中间复合物的学说已得到许多实验证明得到许多实验证明k2k1k32、单分子酶促反应的米氏方程及、单分子酶促反应的米氏方程及Km推导原则推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡稳态平衡”假说的设想进行推导假说的设想进行推导假定：假定：1 1、、[ES][ES]稳态稳态( (浓度保持不变的状态浓度保持不变的状态) )2 2、、[ [底物底物] ]》》[E][E]3 3、、ESES分解成产物的逆反应忽略不记分解成产物的逆反应忽略不记k2k1k3米米氏氏方方程程的的推推导导则则：k2k1k3设 km= ———k2 + k3k1[][][][][]1kESSESSEt=-k2 + k3[ES][ES]生成速度生成速度：： V1=K1( [Et]-[ES]) [S][ES][ES]分解速度：分解速度： V2 2=K2 2[ES]+K3 3[ES]即即：K K1 1([E([Et t]-[ES])[S]=K]-[ES])[S]=K2 2[ES]+K[ES]+K3 3[ES][ES]当酶反应体系处于当酶反应体系处于恒态恒态时时：：V1 = V2 2将（将（4 4）代入（）代入（3 3）则：）则：(1)经整理得经整理得：：将（将（1 1）代入（）代入（2 2）得：）得：(3)(3)当当[Et]=[ES][Et]=[ES]时，时，所以所以 酶促反应速度由酶促反应速度由[ES][ES]决定，即决定，即 （（2 2））(4)(4)[ ]tmEkV3=[ ]ESkv3=[ ][ ][ ]SKSEkmt+=3米氏方程米氏方程:米氏常数米氏常数: km= ———k2 + k3k13 3、、KmKm值（值（米氏常数）的意义（重点）米氏常数）的意义（重点）（（1 1））KmKm的物理意义：当酶促反应速度达到最大反应的物理意义：当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。

速度一半时的底物浓度2 2）） KmKm是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，与酶浓度无关与酶浓度无关3 3）如果一种酶有几种底物，则对每一种底物，各）如果一种酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的有一个特定的KmKm值，其中值，其中KmKm最小的称为该酶的最适底最小的称为该酶的最适底物或天然底物物或天然底物 KmKm还受还受PHPH及温度的影响，因此及温度的影响，因此KmKm作作为常数只是针对为常数只是针对一定的底物、一定一定的底物、一定PHPH、一定温度而言、一定温度而言测定的测定的KmKm值可以作为鉴别酶的手段，但是必须在指定值可以作为鉴别酶的手段，但是必须在指定的实验条件下进行的实验条件下进行酶酶底物底物Km(mmol/L)Km(mmol/L)脲酶脲酶尿素尿素25溶菌酶溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸脱氢酶脱氢酶6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺乙酰酪氨酰胺32.0Km = (k2+k3) / k1（（4 4）） 判断反应速率判断反应速率v v和和VmaxVmax之间的关系：之间的关系： 若已知某个酶的若已知某个酶的KmKm值，就可以计算出在某一底值，就可以计算出在某一底物浓度时，其反应速率物浓度时，其反应速率v v相当于相当于VmaxVmax的百分率。

的百分率或计算任何或计算任何v v下的下的[s][s]用KmKm的倍数表的倍数表示）示） 练习题：已知某酶的练习题：已知某酶的KmKm值为值为0.05mol.L-10.05mol.L-1，要，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的的8080％时底物的浓度应为多少？％时底物的浓度应为多少？ •（（5 5）、）、 KmKm值可以帮助推断某一代谢反应的方值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径，这对了解酶在细胞内的主要催化方向和途径，这对了解酶在细胞内的主要催化方向及生理功能有重要意义向及生理功能有重要意义 •催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的KmKm值往值往往是不同的，测定这些往是不同的，测定这些KmKm值的差别以及细胞内值的差别以及细胞内正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率正逆两向反应的效率VmaxVmax的意义的意义 •在一定酶浓度下，酶对特定底物的在一定酶浓度下，酶对特定底物的VmaxVmax也是一个常数也是一个常数 pHpH、温度和离、温度和离子强度等因素也影响子强度等因素也影响VmaxVmax的数值，的数值，•同一种酶对不同底物的同一种酶对不同底物的VmaxVmax也不同。

也不同转换数的定义转换数的定义•当底物浓度很高时，当底物浓度很高时，Vmax = kVmax = k3 3[ES] = [ES] = k k3 3[E][E]，，k k3 3表示当酶被底物饱和时，每秒表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又叫做转换数常数又叫做转换数( (简称简称TN)TN)，又称为，又称为催催化常数化常数(catalytic constant(catalytic constant，，kcat)kcat)•kcatkcat值越大，表示酶的催化效率越高值越大，表示酶的催化效率越高•主要利用作图法测定主要利用作图法测定Vmax½ Vmax[S]vKm4 4、、 米氏常数的测定米氏常数的测定(1) (1) 测定不同底物浓度的反应初速率，测定不同底物浓度的反应初速率，以以v-[S]v-[S]作图，可以得到作图，可以得到VmaxVmax，再从，再从1/2 1/2 VmaxVmax，可求得相应的，可求得相应的[S][S]，即，即KmKm值(2) (2) 双倒数作图法双倒数作图法1VKm+[S]Vmax[S]=KmVmax.[S]1+Vmax1=V1Vmax1 Km1-[S]1Lineweaver-Burk曲线斜率斜率=Km/Vmax•将米氏方程式两侧取双倒数，以将米氏方程式两侧取双倒数，以1/v--1/v--1/[s]1/[s]作图，得出一直线作图，得出一直线. . 将左式两边均乘以将左式两边均乘以[S][S]得：得：以以[s]/ v[s]/ v～～[s][s]作图，得一作图，得一直线，横轴的截距为直线，横轴的截距为-Km-Km，，斜率为斜率为1/ Vmax 1/ Vmax (3) Hanes(3) Hanes—WoolfWoolf作图法作图法1VKmVmax.[S]1+Vmax1=三、三、pHpH对酶反应速度的影响对酶反应速度的影响 pH影响酶活力的原因：影响酶活力的原因： •(1) (1) 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。

引起酶构象的改变，酶活性丧失•(2) (2) 当当pHpH改变不很剧烈时，酶虽未变性，改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响但活力受到影响 影响了底物的解离状态；影响酶分子活性影响了底物的解离状态；影响酶分子活性部位上有关基团的解离；影响到中间络合部位上有关基团的解离；影响到中间络合物物ESES的解离状态，不利于催化生成产物的解离状态，不利于催化生成产物•(3)(3)影响维持酶分子空间结构的有关基团解影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响酶活性部位的构象离，从而影响酶活性部位的构象四、温度与酶反应速度的关系四、温度与酶反应速度的关系  在达到最适温度以在达到最适温度以前，反应速度随温前，反应速度随温度升高而加快度升高而加快  酶是蛋白质，其变酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上性速度亦随温度上升而加快升而加快  酶的最适温度不是酶的最适温度不是一个固定不变的常一个固定不变的常数数v温度温度温温度度对对酶酶反反应应的的影影响响最适温度最适温度 机理：机理：温度导温度导致酶蛋致酶蛋白变性白变性温度对酶反应的影响温度对酶反应的影响•在最适温度之前，一般温度越高，反应在最适温度之前，一般温度越高，反应速度就越快。

速度就越快•Q Q1010（温度系数）：反应温度提高（温度系数）：反应温度提高10℃10℃，，其反应速率与原来反应速率之比，对大其反应速率与原来反应速率之比，对大多数酶来讲，温度系数多数酶来讲，温度系数Q Q1010多为多为2 2，，•酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力要高通常酶制剂以固体保存为佳通常酶制剂以固体保存为佳 五、激活剂对反应速度的影响五、激活剂对反应速度的影响激活剂激活剂：能提高酶活性的物质：能提高酶活性的物质2 中等大小的有机分子：中等大小的有机分子：辅助因子；辅助因子；可能与酶分子肽链上侧链可能与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子活性构象；基团结合，稳定酶分子活性构象；生生成螯合物，在酶和底物间起桥梁作用成螯合物，在酶和底物间起桥梁作用1 无机离子无机离子金属离子金属离子非金属离子非金属离子（阴离子）（阴离子）还原剂还原剂:Cys、、GSH金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA3 具有蛋白质性质的生物大分子具有蛋白质性质的生物大分子（酶原的激活）（酶原的激活） 一些蛋白酶一些蛋白酶1. 1. 激活剂激活剂(activator)(activator) •激活剂：凡是能提高酶活性的物质。

其激活剂：凡是能提高酶活性的物质其中大部分是无机离子或简单有机化合物中大部分是无机离子或简单有机化合物•金属离子有金属离子有K K+ +、、NaNa+ +、、CaCa2+2+、、MgMg2+2+等离子，等离子，如如Mg2+Mg2+是多数激酶及合成酶的激活剂，是多数激酶及合成酶的激活剂， •无机阴离子如：无机阴离子如：ClCl—、、BrBr—、、I I—等都可作等都可作为激活剂如为激活剂如ClCl—是唾液淀粉酶的激活剂是唾液淀粉酶的激活剂•简单的有机化合物：简单的有机化合物：CysCys对某些含巯基的对某些含巯基的酶有激活作用酶有激活作用 2. 2. 激活剂对酶作用的特点激活剂对酶作用的特点•（（1 1）激活剂对酶的作用具有一定的选择）激活剂对酶的作用具有一定的选择性性 ；即一种激活剂对某种酶起激活作用，；即一种激活剂对某种酶起激活作用，而对另一种酶可能起抑制作用而对另一种酶可能起抑制作用 •（（2 2）有时金属离子之间也可相互替代）有时金属离子之间也可相互替代•（（3 3）激活离子对于同一种酶，可因浓度）激活离子对于同一种酶，可因浓度不同而起不同的作用，低浓度激活，高不同而起不同的作用，低浓度激活，高浓度抑制浓度抑制 六、抑制剂对酶促反应速度六、抑制剂对酶促反应速度 的影响（重点）的影响（重点）•抑制剂抑制剂（（inhibitorinhibitor）） : :使酶的必需基使酶的必需基因或酶的活性部位中的基团的化学性质因或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质。

性的物质•抑制作用抑制作用( (inhibition) :inhibition) :酶的必需基团酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失酶活力的降低或丧失 有选择性有选择性•失活作用失活作用(inactivation) :(inactivation) :使酶蛋白变使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用性而引起酶活力丧失的作用 , ,变性剂对变性剂对酶的变性作用无选择性酶的变性作用无选择性. .抑制剂抑制剂；；抑制作用抑制作用；；失活作用失活作用抑制与失活之间关系的总结抑制与失活之间关系的总结失失 活活抑抑 制制酶蛋白酶蛋白变性变性未变性未变性机机 理理酶蛋白结构酶蛋白结构解体解体必需基团性必需基团性质改变质改变变性剂或抑变性剂或抑制剂制剂无选择性无选择性有选择性有选择性1 1、抑制作用的类型、抑制作用的类型 根据抑制作用是否可逆根据抑制作用是否可逆: : 1 1、不可逆的抑制作用、不可逆的抑制作用: : 抑制抑制剂与酶的必需基团以剂与酶的必需基团以共价键共价键结合而引起酶活力丧失，结合而引起酶活力丧失，不不能用能用透析、超滤等物理方法透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作除去抑制剂而使酶复活的作用用. . 2 2、可逆的抑制作用、可逆的抑制作用: : 抑制抑制剂与酶以剂与酶以非共价键非共价键结合而引结合而引起酶活力降低或丧失，起酶活力降低或丧失，能用能用物理方法除去抑制剂而使酶物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是可逆的复活，抑制作用是可逆的v[E]12非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂 抑抑制制剂剂作作用用于于酶酶分分子子中中的的一一类类或或几几类类基基团团，，这这些些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。

基团中包含了必需基团，因而引起酶失活类型类型：：实例：实例：有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失亲和标记试剂：亲和标记试剂：具有底物类似的结构，可以具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼化学基团和相应的酶结合，同时还带有一个活泼化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性，因抑制是利用酶对底物的亲和从而抑制酶活性，因抑制是利用酶对底物的亲和力来对酶进行修饰标记的，故称之力来对酶进行修饰标记的，故称之 •自杀性底物：自杀性底物： 不但具有天然底物的类似结构，而且也不但具有天然底物的类似结构，而且也是酶的底物，但它还有一个潜伏的反应基团，是酶的底物，但它还有一个潜伏的反应基团，当酶对它进行催化反应时，这个潜伏的反应当酶对它进行催化反应时，这个潜伏的反应基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，这这类抑制剂是专一性极高的不可逆抑制剂，故类抑制剂是专一性极高的不可逆抑制剂，故把这种抑制剂称为自杀性底物。

把这种抑制剂称为自杀性底物 可逆抑制作用可逆抑制作用竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制竞争性抑制（竞争性抑制（competitive inhibition））抑制剂化学结构与底物相似，因而与底物竞争抑制剂化学结构与底物相似，因而与底物竞争性地与酶活性中心结合性地与酶活性中心结合E + PEI+IS+ESE 实例：磺胺药物的药用机理实例：磺胺药物的药用机理H2N- -SO2NH2对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺H2N- -COOH对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸谷氨酸蝶呤蝶呤叶酸叶酸非竞争性抑制（非竞争性抑制（noncompetitive inhibition））酶可以同时与底物与抑制剂结合酶可以同时与底物与抑制剂结合E + PEI+IS+ESES+ESI（不能分解为产物）（不能分解为产物）+I反竞争性抑制反竞争性抑制: 酶只有在与底物结合后，才酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合能与抑制剂结合S+ESE + PEESI（不能分解为产物）（不能分解为产物）+I竞争性抑制作用竞争性抑制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用竞竞争争性性非非竞竞争争性性抑抑制制作作用用机机理理示示意意图图底物与酶专一性结合底物与酶专一性结合2 2、可逆抑制作用的动力学（重点）、可逆抑制作用的动力学（重点）（（1）竞争性抑制的动力学特征）竞争性抑制的动力学特征Vmax不变，不变，Km增大增大竞争性抑制（竞争性抑制（competitive inhibition））抑制剂化学结构与底物相似，因而与底物竞争抑制剂化学结构与底物相似，因而与底物竞争性地与酶活性中心结合性地与酶活性中心结合E + PEI+IS+ESE（（1））V下降下降，发生抑制，发生抑制（（2）） Vmax不变（底物浓度增大，不变（底物浓度增大，抑制剂结合机率减小）抑制剂结合机率减小） （（3）） Km增大，亲和力下降增大，亲和力下降（（2）非竞争性抑制的动力学特征）非竞争性抑制的动力学特征Vmax变小，变小，Km不变不变V=Vmax1+[I]Ki[S]Km+[S]非竞争性抑制（非竞争性抑制（noncompetitive inhibition））酶可以同时与底物与抑制剂结合酶可以同时与底物与抑制剂结合E + PEI+IS+ESES+ESI（不能分解为产物）（不能分解为产物）+I•（（1））V下降，发生抑制下降，发生抑制•（（2）） Vmax减小（一部分酶始终失活）减小（一部分酶始终失活）•（（3）） Km不变，酶与底物亲和力不受影不变，酶与底物亲和力不受影响响 （（3）反竞争性抑制的动力学特征）反竞争性抑制的动力学特征Vmax变小，变小，Km变小变小V=Vmax1+[I]Ki[S]Km1+[I]Ki+[S]反竞争性抑制反竞争性抑制: 酶只有在与底物结合后，才酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合能与抑制剂结合S+ESE + PEESI（不能分解为产物）（不能分解为产物）+I。