实验,固体发酵纤维素酶米氏常数km的测定,用秸秆作为材料.docx

为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划实验,固体发酵纤维素酶米氏常数km的测定,用秸秆作为材料　　实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验　　一、实验目的　　1、了解纤维素酶的生产工艺和原理2、掌握液体发酵和固体发酵工艺　　3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理二、实验原理　　纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂　　以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量，可以计算酶活力高低还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比三、材料与试剂配制　　1、生产菌种：黑曲霉　　2、斜面培养基：酵母膏%，蛋白胨%，可溶性淀粉1%，葡萄糖%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水配制，　　3、人工海水：NaCl=24g/L;MgSO4·7H2O=g/L;NH4NO3=1g/L;KCl=g/L;NaH2PO4=g/L;Na2HPO4=g/L,。

　　4、微量元素液：FeSO4·7H2O/L，MnSO4·H2O/L，ZnSO4·7H2O/L，CoCl2/L，加蒸馏水200ml使之溶解　　5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源3g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1g，蛋白胨作有机氮源，人工海水100ml，自然pH值　　6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5g，人工海水12ml，自然pH值　　7、6%DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g，,5g苯酚，5g无水亚硫酸钠，加热搅拌溶解，冷却后定容至1000ml储存在棕色瓶中放置一周后使用　　8、mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液　　/L柠檬酸钠溶液100mL:称克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度　　/L柠檬酸溶液100mL:称克柠檬酸(柠檬酸的分子量为)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度　　的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液100mL:量取/L柠檬酸钠溶液54mL和/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀　　91%CMC-Na溶液　　称取克羧甲基纤维素纳，用pH的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液加热溶解。

10标准葡萄糖溶液　　1mg/mL葡萄糖溶液250mL:准确称取无水葡萄糖250mg，溶解定容到250ml11、主要仪器：恒温培养箱，摇床培养箱，可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天平等四、实验步骤　　1、培养基配制　　分别按上述方法配制液体发酵培养基和固体发酵培养基，121℃灭菌20分钟2、孢子悬液的制备：将斜面培养基上的曲霉孢子用少量无菌人工海水洗下，利用玻璃珠在磁力搅拌下搅拌15~20分钟，充分打散孢子，稀释成5x107个/ml左右的孢子悬液　　2、液体发酵产酶试验　　按6%接种量将浓度约为5×107个/ml的菌株孢子悬液接入已灭菌的液体发酵培养基，于35℃、180r/min条件下摇床培养6天发酵液4℃、5000r/min离心15min，上清液稀释10倍，测定发酵液中的酶活力　　3、固体发酵产酶试验　　7　　100ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培养基，按1:3(v/w)接种量将浓度约为5×10　　个/ml的菌株孢子悬液，于35℃恒温培养箱中培养，接种48小时后隔天翻曲一次，第四或第五天补充无菌水保持基质水分培养6天后，取发酵成熟曲1g，加蒸馏水10ml，搅拌均匀，30℃，浸提lh，双层纱布过滤，滤液经4℃，5000rmp离心15min，上清为粗酶液。

测定时适当分级稀释，使OD540在~范围　　4、酶活力测定及酶活力定义葡萄糖标准曲线绘制　　准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml分别吸取此液,,,,ml至5个25ml的比色管中，用蒸馏水定容到25ml(即加水24,23,22,21,20ml)　　再分别吸取上溶液各于比色管中，各加试剂，煮沸5min标准葡萄糖DNS含糖量　　OD540　　1-0　　2-　　3-　　4-　　5-　　6-　　以糖含量为横坐标，A540为纵坐标，绘制标准曲线　　内切葡聚糖酶(CMCase)酶活：取适当稀释的酶液ml，加入ml1％(W/V)的CMC-Na溶液(溶于mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液，pH)，60℃反应30min，加入mlDNS终止反应，沸水浴显色5min，测定OD540以灭活酶液作对照　　滤纸酶(FPA)酶活：取50mg(1Χ6cm)新华滤纸，加入酶液ml，再加入pH的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液ml，50℃反应lh，其它同前　　酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)　　酶活力=量，mg五、实验记录　　1.固体培养基：　　6月20日接种6月21日15点00分无现象6月22日16点05分出现白色菌丝体6月24日10点出现大量白色菌丝体和少量黑色孢子6月25日8点出现大量黑色孢子，白色菌丝体比前天少些　　2.液体培养基：　　6月20日接种6月21日15点00分无现象6月22日16点05分液体颜色变深了6月24　　A?1000　　式中A为由标准曲线查得或回归方程算得的还原糖含　　30??180　　日10点液体变稠、变黑、出现少量黑色孢子6月25日8点出现大量黑色孢子六、实验数据　　1.葡萄糖标准曲线OD数据　　管号蒸馏水标准葡萄糖DNS含糖量　　OD540　　1-0　　2-　　　　3-　　　　4-　　　　5-　　　　6-　　　　2.酶活力测定OD数据　　七、数据处理　　实验数据：CMCase:OD540液体培养基=固体培养基=FPA:OD540液体培养基=OD540固体培养基=　　又由y=得x=(y+)/解得：CMCase：x液体=x固体=FPA：x液体=x固体=因为酶活力=　　A?1000　　则：　　30??180　　A?1000　　?10=?1000?10/30??180=/ml　　30??180　　CMCase：液体酶活力=　　固体酶活力=　　FPA：液体酶活力=固体酶活力=八、结果分析　　A?1000　　?10?10=?1000?10?10/30??180=/g　　30??180　　A?1000　　?5=?1000?5/30??180=/ml　　30??180　　A?1000　　?10?10=?1000?10?10/30??180=/g　　30??180　　从实验整体看，实验还是成功的，不过还有不少方面存在问题：　　1.由标准曲线中，R2=小于，相关性较弱，可能在各种试剂配制不够准确以及实验操作不够规范。

分析原因有：葡萄糖标准溶液定容操作出现失误，DNS的加入各个管存在误差，缓冲液配制不精确，测OD值实验操作不严谨　　2.为使固体发酵培养得菌种充分利用培养基需及时翻曲，能使其能在培养基的其他部位也长出菌落，提高酶产量由于翻曲不充分，菌种只在培养基上部生长　　3.液体发酵培养时需在摇床上摇荡培养，菌体生长时能更有效率的利用营养物质，从培养结果看，菌种生长状况良好　　实验课题项目书　　一、研究的内容与意义　　内蒙古自治区分布和蕴藏着2324种具有药效的野生植物、动物和矿物其中可大规模开发利用的品种有232种我区分布的道地中蒙药材品种有102种，如甘草、麻黄、防风、黄芪、黄芩、肉苁蓉、北沙渗、桔梗等都是我区道地中蒙药材，在全国乃至世界都非常著名内蒙古自治区野生药材蕴藏量其中野生甘草655万亩,半野生60万亩、苦豆子40万亩、麻黄草万亩按销售额计算我区位列全国八大中药材产业基地的第七位，在国内外有较高的知名度[1]　　由于中草药标本兼治的神奇疗效，越来越多的现代化药厂通过水或有机溶剂来提取中药中的有效成分并将其制成方便携带的中成药制剂但同时每年也产生了数千万吨的中药残渣，据统计,国内的大多数中药材厂对中药材废渣的处理主要是填埋和作为固体废物任意排放。

然而中药材废渣量大、填埋堆放孔隙率高,残渣含有50%~80%的水分且容易腐烂变质，不仅造成大片耕地损失,污染水源和大气,而且还造成不必要的能源浪费，因此是重要的环境污染源之一[2]　　但现在，我国对中草药的生产大多处于粗加工水平，仅对其中某些有效成分进行提取、加工，提取率不高因此，药渣中除含有大量的粗蛋白、粗脂肪、纤维素外，还含有维生素、矿物质等，以及生物活性物质和一些未知的促生长的物质[3]几种药渣中含有丰富的Fe，　　Zn，Cu，Mn元素，且各种药渣中铁含量均很高，不同药渣中各元素含量不同，所以可根据药渣中可以利用的也有效物质含量不同进行再利用，并减少药渣对环境造成的污染[4]　　由此可见，如何能够将这类生产过程产生的富含纤维素生物质过程残渣实施能源转化，使其有益的成分得以为人们所利用已成为生物、环境及能源等领域的研究热点尽管研究者们在中药渣的综合利用方面做了许多探索，但对采用中药渣应用固态发酵模式制备纤维素酶的研究鲜有报道纤维素酶是一类能够水解纤维素，并在生物质能源转化过程中起关键作用的酶系在国内外近30年报道的纤维素酶生产工艺主要有液体发酵和固体发酵模式其中固体发酵模式能利用农作物秸秆或工业废料残渣等作为培养基质，因此，利用中药渣采用固态发酵方式生产纤维素酶，不仅可以避免中药渣带来的环境污染，还可以使中药渣成为纤维素酶生产的新来源，为中药渣的综合利用提供了一条新途径。

[5]　　二、拟采取的研究、技术路线　　1材料与方法　　中药渣将中药渣粉碎至60目后干燥备用　　测定中药残渣成分　　例：丹皮残渣成分测定结果：半纤维素含量%，纤维素含量　　%，木质素含量%，丹皮酚含量%，可用于固态发酵产纤维素酶　　菌种绿色木霉Sn-9106　　主要培养基斜　　面培养基：2%葡萄糖为碳源的PDA培养基用于菌种活化、保藏　　液体种子培养基：麸皮/L，米糠/L，/L，/L，/L，葡萄糖/L，，用于固体发酵接种　　基础固体发酵培养基：/L，/L，尿素/L，MgSO4·/L，/L，麸皮/L，中药残渣/L，，用于纤维素酶的诱导培养　　实验方法　　固体发酵产酶　　活化好的斜面菌种2~3环接种于液体种子培养基中，置于恒温振荡培养箱中，28℃、120r/min培养72h向培养皿中加入等量固体发酵培养基质混拌均匀后，于126℃高压灭菌40min，取出后冷却至室温，将液体种子按10%接种量接入固体发酵培养基中，搅拌均匀，28℃培养72h将发酵好的固体发酵物加入碳源重量6倍蒸馏水的体积浸提1h，8层纱布过滤，再将滤液4000r/min离心15min，即可得到纤维素粗酶液，用于后续的纤维素酶活测定。

　　酶活测定　　滤纸酶活力、β-葡萄糖苷酶活力、CMC活力测定方法按参考文　　献[10]所述方法进行酶活力单位定义：按国际单位制计算，每克干曲每分钟转化1μmol产物所需要的酶量定义为一个酶活力单位　　培养基优化实验设计　　麸皮对纤维素酶产量的影响　　发酵培养基中其他条件不变，选择麸皮浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，对菌株Sn-9106进行发酵培养，测定滤纸酶的活力　　氮源对纤维素酶产量。