检测蛋白质中氨基酸的含量的各种方法及优劣讨论.docx

蛋白质中氨基酸的含量测定组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链蛋白质 是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，其含量测定是生化药品研究中最常 用、最基本的分析方法之一目前其常用的测定方法有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、BcA法、考马 斯亮蓝法、紫外分光光度法及荧光法1凯氏定氮法1．1方法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾 一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵然后碱化蒸 馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以氮转化 为蛋白质的换算系数，即为蛋白质的含量本法各国药典收载的方法一致故 参照《中国药典》2005 年版三部［41 附录方法，按纯蛋白类供试品及添加无机 含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品分别拟定各测定方法1．2 讨论1．2．1凯氏定氮法虽耗时较长，但它是蛋白质测定方法中最经典的测定方法，本 法所测的结果为蛋白质绝对浓度而非相对浓度，可用于标准蛋白质含量的准确 测定1．2．2本法灵敏度较低，适用于0. 2〜2．o mg 氮的测定，干扰少1. 2. 3蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质的含氮量为16％，故含氮量 转化为蛋白质的系数为6．25。

但由于不同蛋白质的结构差异，其换算系数会稍有区别，如乳制品 为6．38，动物胶为 565等，因此一些特殊蛋白质应在各论中相应说吩其转 化系数1．2．4在本法附注中起草了非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的 测定，一般采用钨酸沉淀法，但当供试品中含有氨基酸(精氨酸)时，由于其会影 响蛋白质的沉淀，故建议采用三氯醋酸沉淀法方法(1) 与方法(3)的线性相关系数均能达到0．999 以上，较理想；方法(1)试剂配制繁琐且整个实验费时长，而方法(3)操作更简便快速按各方法测试后的溶液放置30 min 后重新测定其吸光 度，3 种方法溶液的吸光度均略有降低，结果变异均在1％以内根据上述考察 结果，故本文参照《国家药品标准》地标升国标制定本法2xx 酚 xx(lowryxx)2．1本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白 质．铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱 性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在 一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量本法各收载的方法中碱陛铜试液 的配制、福林酚试液的酸浓度、测定波长及比色条件略有不同。

本文对各种方 法的线性、稳定陡进行了考察2．2 讨论2．2．1本法福林酚试液中使用的福林试液贮备液的配制在《中国药典》二部附录 中有收载，其酸浓度为 2m01. L〜，目前也有市售产品，但酸浓度可能有所差异，故应根据实际福林 试液贮备液酸浓度的高低对最终福林酚试液的配制进行调整2. 2. 2福林-酚试液仅在酸性pH条件下稳定，但第二步的还原反应只在pH=10的 情况下发生，故当酚试剂加到碱性铜一蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便 在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生，否则会使显色程度减 弱2. 2. 3本法干扰物质较多，还原物质、酚类、柠檬酸、硫酸铵、％s缓冲 液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用2. 3. 4本法灵敏度高，比双缩脲法高100倍，通常测定范围为20〜 250“g3 双缩腺法3. 1本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与cu2+形成紫 红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品 溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量本法各收载的方法 中双缩脲试液的配制、测定波长及比色条件略有不同本文对各种方法的线 性、稳定性进行了考察。

方法(1)与方法(3)的线性相关系数均能达到0．999 以上，较理想；方法(1)溶液的吸光度偏高同时其操作过程中需分别加入两种反应试剂，而方法(3)操作更简便，比色条件为室温按各方法测试后的溶液放置30 min 后重 新测定其吸光度，方法(1)和方法(2) 溶液的吸光度略有增加，方法(3) 溶液的吸光度基本不变3．2 讨论3．2．1 加人双缩脲试剂后需立即快速混匀3．2．2 本法测定较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，干扰物质较 少，干扰测定的物质主要有：硫酸铵、％s缓冲液和某些氨基酸等3. 2. 3本法灵敏度差，测定范围为1〜10 mg4 2, 2'-联喹啉_4, 4'-二羧酸法(BCA法)4. 1本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为cu+, BCA(2, 2'一联喹 啉4, 4'一二羧酸)与Cu+结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白 质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋 白质的含量本法仅收载于《欧洲药典》6．0 版、《英国药典》2009 年版与《美国药典》32 版附录中且方法基本一 致故本文参照国外药典制定本法经试验，牛血清白蛋白对照品在84. 7〜423．6 峭浓度范围内线性关系良好，吸光度为0. 187〜0. 907，相关系数为0. 999 1。

4. 2 讨论4. 2. 1 本法显色后溶液吸光度随时间的增加而明显增加，故溶液显色后应 于 562nm 的波长处立即测定吸光度4. 2. 2 本法干扰物质少但样品中不能有还原剂和铜螯合物，否则影响测 定4. 2. 3 本法灵敏度较高，测定范围为80〜400 斗 g5考 xxxxxx(Bmdfordxx)5. 1本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G笛与蛋白质分子中的碱性氨基酸 (精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白 质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋 白质的含量本法仅收载于《欧洲药典》6. O 版、《英国药典》2009年版与《美国药典》32 版附录中且方法基本 一致故本文参照国外药典制定本法经试验，牛血清白蛋白对照品在1. 059〜105. 9 斗 g 浓度范围内线性关系良好，吸光度为0．0050．630，相关系数为0．99965．2 讨论5．2．1 本法测定吸光度时不可使用石英比色皿(因石英中的二氧化硅会与 染色物结合，不易洗去)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95％的乙 醇荡洗，以洗去染色5. 2. 2加入考马斯亮蓝G-2S0试剂来回翻转混匀时，注意不要太剧烈，以 免产生大量气泡而难于消除，干扰测定。

5. 2. 3本法显色后溶液不稳定，故溶液显色后应于595nm的波长处立即 测定吸光度主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、七二烷基硫酸钠(SDS )等，样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色5. 2. 4 本法蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合 物有更高的吸光系数，吸光度随蛋白质浓度的变化比福林-酚法要大因而灵敏 度高，可测定1—200斗g的蛋白浓度g6 紫外分光光度法6. 1本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基 酸：其在 280nm 波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓 度呈正比本法《欧洲药典》6. 0 版、《英国药典》2009 年版与《美国药典》32 版附录中均收载且方法 基本一致，而《中国药典》2005 年版未收载该方法，仅在国家药品标准中一些 少量品种检查项下用于蛋白质的检查本文参照国外药典及相关文献制定本 法6．2 讨论6．2．1 紫外分光光度法测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，但操 作简便快速，适用于纯化蛋白质的微量检测，如用于柱层析洗脱液的快速连续 检测，测定蛋白质浓度变化而不需要其绝对值或中间体的快速测定。

6．2．2 用对照品比较法测定蛋白质含量时，当供试品与对照品中酪氨酸和 色氨酸含量差异较大时会产生一定的误差故适用于测定与对照蛋白质氨基酸 组成相似的蛋白质6. 2. 3由于蛋白质吸收峰常因pH值的改变而有所变化，因此要注意溶液 的 pH 值6. 2. 4蛋白质浓度（mg・mL“）二1. 45xA280 一0. 74xA：g,此公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸 （酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的7 小结7. 1 蛋白质含量测定方法中各国药典常用的对照品有牛血清白蛋白、人血 白蛋白、酪蛋白、免疫球蛋白及各品种的自身对照品等本文采用牛血清白蛋 白对各测定方法进行了考察，建议在中国药典各论中应根据品种尽可能选用与 品种蛋白质结构相近的蛋白质对照品7. 2 本文建立的蛋白质含量测定方法经六个省市芩暴红止咳口服液的质量 标准研究药检所进行了复核，综合各复核意见，收载的六种蛋白质测定方法的 线性、精密度结果均较好但由于各测定方法依据的蛋白质反应原理不同，同 时由于各品种的蛋白质性质、结构的迥异导致同品种采用不同的测定方法其结 果有较大差异故建议不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并 做相应方法学验证后再收载在药典各论中。