cerna机制及研究方案介绍.pptx

ceRNA机制及研究方案介绍,,1,目录,,,,,2,miRNA作用方式,,3,RNA和miRNA作用方式,4,RNA——miRNA：1对多；多对1；多对多,ceRNA的逻辑关系,5,ceRNA假说（competitive endogenous RNA，竞争性内源 RNA）: 共享miRNA结合位点的转录本会竞争性结合相同的miRNA,ceRNA机制的生物学功能,RNA转录本通过与编码RNA竞争性的结合microRNA，从而稀释掉细胞内游离microRNA的浓度，降低microRNA对编码RNA的抑制，进而提高目的基因的表达量,6,ceRNA的种类,7,ceRNA部分研究结果,8,ceRNA的国自然面上项目申请状况,9,10,ceRNA的课题申请状况,ceRNA的方案设计,ceRNA关系对的获取及基本qPCR分析； ceRNA关系对中各成分与疾病相关性验证； ceRNA关系对中的竞争性关系的验证；,11,12,ceRNA关系对的获取,13,ceRNA的验证试验（LncRNA为例）,实例分享一：,LncRNA pagbc对miRNA的海绵调控作用促进胆囊肿瘤发生,Wu X, Wang F, Li H, et al. LncRNA‐PAGBC acts as a microRNA sponge and promotes gallbladder tumorigenesis[J]. Embo Reports, 2017.（IF 8.568） 高通量测序+qPCR验证+LncRNA功能验证,14,文献一技术路线,15,目的LncRNA的确定,高通量测序 LncRNA+miRNA测序：9对胆囊癌与癌旁组织 选取5条LncRNA在26对癌与癌旁组织进行qPCR验证 构建lncRNA-PAGBC-mRNA的基因共表达模型,16,目的LncRNA的确定,验证LncRNA-PAGBC在大样本中的表达 在60个癌与癌旁组织中进行lncRNA-PAGBC表达量的统计分析，证明lncRNA-PAGBC与癌症的相关性,17,目的LncRNA的确定,对77个病例进行关于lncRNA-PAGBC的生存分析,对lncRNA-PAGBC进行两个细胞系中进行亚细胞定位,18,目的LncRNA的确定,在胆囊癌细胞系（GBC、NOZ）中进行lncRNA PAGBC 沉默，分析细胞增殖及裸鼠成瘤,19,目的LncRNA的确定,在胆囊癌细胞系中进行lncRNA PAGBC 过表达，分析癌细胞的迁移、侵袭和成瘤能力,20,LncRNA‐PAGBC的与miRNA关系对确定,整合LncRNA与miRNA数据，预测出PAGBC的6条靶miRNA 选用双荧光素酶报告系统进行关系对验证（293T细胞、NOZ细胞）,21,LncRNA‐PAGBC的靶基因确定,结合miR-133b、miR-511靶基因预测以及篇首的高通量数据，推测出靶基因SOX4 和PIK3R3 癌细胞中分别转入LncRNA‐PAGBC的突变体（分别针对miR-133b、miR-511结合位点）后，进行靶基因表达检测,22,LncRNA‐PAGBC的目的基因确定,癌细胞中分别转入LncRNA‐PAGBC的突变体、过表达+miRNA inhibitor、miRNA mimic，进行靶基因表达检测,23,结论,通过高通量测序发现与胆囊癌相关的特定LncRNA，经过在病例中的检测初步筛选出目的LncRNA； 沉默、过表达LncRNA在体内及体外的功能试验，验证出LncRNA‐PAGBC与胆囊癌细胞的增殖有关系； 通过生信分析从LncRNA‐PAGBC预测出6个靶miRNA中，通过体内、体外试验确定出其靶标miR-133b、miR-511； LncRNA‐PAGBC通过竞争性的与miR-133b、miR-511结合，促进SOX4 和PIK3R3表达升高，进而活化了AKT/mTOR通路；,24,lncRNA HOTAIR在肾癌细胞中通过miR-217调节HIF-1α/ Axl信号途径 高通量测序+qPCR验证+LncRNA功能验证,Quan H, Ou L, Wei Z, et al. LncRNA HOTAIR regulates HIF-1α/AXL signaling through inhibition of miR-217 in renal cell carcinoma[J]. Cell Death & Disease, 2017, 8(5):e2772.（IF 5.965）,25,实例分享二：,研究路线,26,皮肤黑色素瘤中的竞争性内源RNA调控分子机制 高通量测序+qPCR验证+circRNA功能验证 Xu S, Jing S, Sheng Y, et al. Integrative analysis of competing endogenous RNA network focusing on long noncoding RNA associated with progression of cutaneous melanoma[J]. Cancer Medicine, 2018(8 Suppl). （IF 3.362）,27,实例分享三：,方案设计,测序+qPCR：15W；IF：4分左右； 功能试验：15-25W；IF：3-5分左右； 测序+qPCR+功能试验：35-40W；IF：6-8分,28,Salmena L, Poliseno L, Tay Y, et al. ceRNA hypothesis: The Rosetta Stone of a hidden RNA language?[J]. Cell, 2011, 146(3):353-8. Thomson D W, Dinger M E. Endogenous microRNA sponges: evidence and controversy[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(5):272.,29,参考文献,感谢聆听！欢迎交流学习！,,30,。