分子克隆上的标准配方.pdf

分子克隆上的标准配方1.PBS： 10×， 1000 ml 137 mmol/L NaCl MW ：58.44 80 g 2.7 mmol/L KCl MW ：74.55 2 g 10mol/L Na2HPO4·12H2O MW ：358.14 36 g 2mmol/L KH2PO4MW ：136.09 2.4 g 10×储存液： 1000 ml ddH2O 溶解 80 g NaCl， 2 g KCl ， 36 g Na2HPO4·12H2O， 2.4 g KH2PO4， 室温保存 1× 工作液： 使用时取出100 ml 10 ×PBS，加 ddH2O 至 800 ml ，HCl 调节 pH 至 7.4，加 入 ddH2O 定容至 1000 mlPBS: 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4. 2.Running Buffer ： 10×， 1000 ml 25 mmol/L Tris MW ：121.14 30.3 g 250 mmol/L Glycine MW ：75.07 187.7 g 0.1%（m/V）SDS 10 g 10×储存液： 900 ml ddH2O 加入 30.3 g Tris，187.7 g Glycine ，10 g SDS，60°C 加热搅拌促 进溶解，定容到1000ml，室温保存。

1× 工作液： 使用时取出100 ml 10×Running Buffer ，加入 ddH2O 至 1000 ml 注意回收利用3.Transfer Buffer ：10×， 1000 ml 24 mmol/L Tris MW ：121.14 29.1 g 192 mmol/L Glycine MW ：75.07 144 g 20% methanol 10×储存液： 1000ml ddH2O 溶解 29.1 g Tris ，144 g Glycine ，室温保存 1× 工作液： 使用前取出100 ml 10 × Transfer Buffer ，加入 200 ml methanol （若蛋白分子 量较大如超过100kDa，加入 100 ml methanol 即可） ，加入 ddH2O 定容至 1000 ml，4°C 预冷 注意回收利用4.TBS： 10×， 1000 ml 137 mmol/L NaCl MW ：58.44 80 g 2.7 mmol/L KCl MW ：74.55 2 g 25 mmol/L Tris MW ：121.14 30 g 10×储存液： 1000 ml ddH2O 溶解 80 g NaCl，2 g KCl ，30 g Tris ，室温保存。

1× 工作液： 使用之前取出100 ml TBS ，加入 ddH2O 定容至 1000 ml，加入 1 ml Tween-20 混匀 pH 调至 7.4 5．1.5mol/L Tris·HCl （pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至 8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温高压灭菌或过滤，室温 下保存注；应使溶液冷却至室温后在调定PH，因为 Tris 溶液的 PH值随温度变化差异很大6．0.5mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水200ml 溶解后，用浓盐酸调pH 至 6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存 7．1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水200ml 溶解后， 用浓盐酸调pH 至所需点， 最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温保存 PH HCl 7.4 约 17ml 7.5 约16m 7.6 约 15ml 8.0 约10ml 8．1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇100ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中， -20℃保存 。

9． 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（ MW119.98 ）12g 蒸馏水至500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存10．0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO ·12H2O（ MW 358.14 ）71.6g 蒸馏水至1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存11．10％SDS SDS 10g 蒸馏水至100ml 50℃水浴下溶解，室温保存如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用12．10％过硫酸胺（ AP） 过硫酸胺0.1g 超纯水1.0ml 溶解后， 4℃保存，保存时间为1周 （可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）13．40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（ Acr）37.5g 甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g 超纯水至100ml 溶解后 4℃保存 使用时恢复至室温且无沉淀14．20％Tween20 Tween20 20ml蒸馏水至100ml 混匀后 4℃保存 15．单去污剂裂解液（含有PMSF） 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX-100 0.5ml 蒸馏水至50ml 混匀后 4℃保存 。

使用时，加入PMSF 至终浓度为100μg/ml（ 0.87ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：0.5M Tris-HCl (pH 8.0) 10ml 150 mM NaCl 10ml 1 mM EDTA 可省略1% NP40 1ml 1% 脱氧胆酸钠0.5g 10% SDS 1ml ddH2O 78ml 4°冰箱保存，临用前90ul 加入 1 mM PMSF 1ul+10ul cocktail RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer)150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 or Triton X-100 0.5% sodium deoxycholate 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate) 50 mM Tris, pH 8.0 注：The 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) must be protected from light. 16． TBST缓冲液 20％Tween-20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。

17．G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝 G250 100mg 95％乙醇50ml 磷酸100ml 蒸馏水至1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水混匀，用滤纸过滤，4℃保存18．0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44 ）0.877g 蒸馏水至100 ml 高温灭菌后，室温保存19．100mg/ml 牛血清白蛋白（ BSA）BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后 -20℃保存 制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl 进行 100倍稀释成1mg/ml， -20℃保存用于抗体稀释时，WB用1*TBST ，IF用PBS20．还原型 5XSDS 上样缓冲液0.5 mol/L Tris·HCl（ pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（ DTT ，MW154.5 ） 0.39g SDS 0.5g 溴酚蓝 0.025 甘油 2.5ml 混匀后，分装于1.5ml 离心管中， 4℃保存21．10X丽春红染液丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml 使用时将其稀释10倍。

22．TBS 缓冲液1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸馏水至 1000ml （可以配制成 10× TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用） 10×TBS ：1000ml 137mmol/L NaCl MW ；58.44 80g 2.7mmol/L KCl MW ；74.55 2g 25mmol/L Tris MW；121.14 30g 10×储存液： 1000 ml ddH2O 溶解 80 g NaCl，2 g KCl ，2gKCL ，30g Tris ，室温保存1× 工作液：使用时取出100 ml 10× TBS， 加 ddH2O 至 1000 ml， 加入 1mlTween-20 1ml ，l 调节 pH 至 7.4TBS 10x (concentrated TBS) 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl Mix in 800 ml ultra pure water.pH to 7.6 with pure HCl.Top up to 1 L. TBST For 1 L: 100 ml of TBS 10x + 900 ml ultra pure water + 1ml Tween2023． 封闭液脱脂奶粉（国产，光明牌） 5 g TBST 100ml 最好现用现配。

24．洗脱抗体缓冲液14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β -巯基乙醇 ) 700 μl （通风厨里加）SDS 2g 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml 配制时，在通风厨内进行4℃保存可重复使用1次可用可不用） 25．显影液（ 5X）自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）米吐尔 1.55g 亚硫酸钠（无水） 22.5g 碳酸钠（无水） 33.75g 溴化钾 20.95g 补水至 500ml 配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂4℃保存使用时用自来水稀释至1倍26．定影液自来水（ 50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠 240g 亚硫酸钠（无水） 15g 冰乙酸 12.6ml 硼酸 7.5g 钾明矾 15g （水温冷至 30℃以下时再加入）加水定容至 1000ml，室温保存27. Nonidet-P40 (NP40) buffer 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 ( 或 Triton X-100 ) 50 mM Tris, pH 8.0 28. Tris-Triton buffer 10 mM Tris, pH 7.4 100 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM EGTA 1% Triton X-100 10% glycerol 0.1% SDS 0.5% deoxycholate All four of these buffers will keep at 4oC for several weeks or for up to a year aliquotted and stored at -20oC. 29 Stripping and Reblotting 若内参与目的蛋白的分子量接近，可在检测完目的蛋白后用Stripping buffer 室温 stip膜 30min 后重新封闭及随后的过程，以检测上样量是否一致。

常用内参： B-ACTIN （42KD ）,B-TUBLIN (50KD), A-TUB。