大鼠糖尿病视网膜病变模型建立及超微结构观察.doc

1大鼠糖尿病视网膜病变模型建立及超微 结构观察【摘要】 目的 建立链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠视网膜病变模型并观察视网膜微血管及视细胞的超微结构，评价其应用价值方法 选择健康成年雄性清洁型 SD 大鼠 60 只，随机分为正常对照组、糖尿病 1 个月组、糖尿病 3 个月组、糖尿病 6 个月组大鼠一次性腹腔注射 STZ 诱发糖尿病模型，观察各组大鼠的生理指标，并对糖尿病模型大鼠进行视网膜组织学检查及微血管超微结构观察结果 STZ 腹腔注射糖尿病大鼠成模率为 100%，死亡率为 4.4%早期糖尿病大鼠视网膜厚度变薄，视细胞数目随月龄增加而逐渐减少毛细血管内皮细胞水肿，线粒体肿胀毛细血管基底膜增厚，管腔狭窄，甚至闭塞视细胞外节膜盘间隙扩大，排列紊乱内节线粒体水肿，排列不规则结论 STZ 诱导的糖尿病大鼠视网膜病变模型成模率高、方法可靠；糖尿病大鼠视网膜病变在发生发展、病理变化等方面与人类糖尿病视网膜病变具有相同或相似的特征，应用此模型可对糖尿病视网膜病变的病理学、发病机制和药物治疗等多方面进行研究 【关键词】 糖尿病视网膜病变 视网膜 超微结构 模型 动物 大鼠 ［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a model of early diabetic retinopathy in rat and study the retinal ultrastructural changes. MethodsSixty adult male SD rats were divided into four groups: normal control group (CON), diabetes for 1 month (DM1), diabetes for 3 months (DM3), diabetes for 6 months (DM6). The diabetic rat model was induced by intra peritoneal injection of streptozotocin (STZ). Physiological factors of the rats were examined and the retinal pathology and ultrastructural changes studied. ResultsDiabetes was induced in all of the rats. The mortality of the rats was 4.4%. Ultrastructural study showed that the retina became thinner in early diabetic rats. The number of visual cells became decreased along with duration of the experiment. The capillary endothelial cells and mitochondria became swollen. The basement membrane of capillaries became thicker. There was narrowing and even occlusion of the capillary lumen. The membrane disc space of visual cell outer segment was enlarged and arranged disorderly. The mitochondria of inner segments was swollen and arranged 2irregularly. ConclusionThe diabetic retinopathy rat model induced by intra peritoneal injection of streptozotocin (STZ) shows similarities in the development of retinal lesions and ultrastructural changes to human diabetic retinopathy. With its easy manipulation and higher succes rate, the model can be potentially used for pathological, etiologic and therapeutic study of retinopathy. ［KEY WORDS］diabetic retinopathy; retina/ultrastructure; models, animal; rats 糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病病人在眼部的常见并发症之一，在发达国家已成为主要的致盲眼病［1］。

对早期 DR 的发病机制仍在探讨中，建立与人类 DR 有相似特征的动物模型，以用于 DR 的基础及临床治疗是目前研究的热点之一本研究采用化学药物链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病模型，对成模后的大鼠视网膜进行视网膜组织形态学、视细胞及毛细血管超微结构的观察，以探讨该动物模型在 DR 研究中的应用价值 1 材料和方法 1.1 实验动物及分组 选择清洁型雄性 SD 大鼠 60 只，体质量 200～250 g，由青岛市药检所实验动物中心提供所有大鼠均饲养在标准化动物中心，单笼标准饲料喂养，自由进食和饮水，室温 18～22 ℃随机分为对照组（CON 组）及实验组的糖尿病 1 个月组（DM1组）、糖尿病 3 个月组（DM3 组）、糖尿病 6 个月组（DM6 组），每组大鼠 15 只 1.2 大鼠糖尿病模型的建立 实验组应用 STZ（Sigma 公司产品）诱发糖尿病血糖测定使用美国强生 Lifescan公司生产的 One Touch 血糖仪和标准血糖试纸用 0.001 mmol/L 柠檬酸盐缓冲液配成 10 g/L 的 STZ实验组大鼠按 60 mg/kg 剂量左下腹腔内注射 STZ72 h 后取尾血测血糖及尿糖。

凡血糖≥16.7 mmol/L 及尿糖阳性的大鼠定为糖尿病模型 1.3 检测指标 成模后每周测 1 次尿糖，每月测 1 次血糖、24 h 尿量和体质量 1.4 组织学处理 3各组大鼠饲养到期后，行腹腔麻醉，摘除眼球，环行剪开角膜缘，置 40 g/L 多聚甲醛固定 24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片 1.5 视网膜超薄切片制备及透射电镜观察 每组随机选择 5 只大鼠，行腹腔注射麻醉，摘除眼球，于角膜缘后 0.5 mm 沿赤道方向环行剪开眼球，去除眼前节，将含视网膜的眼杯放入 25 g/L 戊二醛溶液固定 2 h；显微镜下剥离视网膜，取颞上及颞下视网膜组织，切成 1.5 mm×2.0 mm 大小长方形组织块，用 PBS 缓冲液冲洗，四氧化锇固定 2 h,梯度乙醇、丙酮逐级脱水后,EPON812 浸透包埋首先切成 1 mm 厚半薄片做光镜定位，然后制备超薄切片，常规醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色，用 Philips EM208s 透射电镜观察视网膜毛细血管及视细胞的超微结构 1.6 统计学处理 实验数据用±s 表示，数据由 SPSS 10.0 统计软件包进行处理，统计学分析采用 F检验、t 检验。

2 结 果 2.1 实验大鼠情况 对照组大鼠每日饮水量少，尿量少，毛色光滑，体质量随周龄增大而稳步增长，实验过程中无死亡大鼠；45 只腹腔注射 STZ 大鼠于 72 h 后，血糖和尿糖均达成模标准实验组大鼠成模后第 2 周即出现多饮、多食、多尿等糖尿病症状，体质量减小，DM3 组和 DM6 组各有 1 只大鼠因消瘦、进食困难死亡 2.2 血糖、尿糖、24 h 尿量及体质量检测 15 只正常对照组大鼠尿糖均阴性，实验组大鼠尿糖 实验组大鼠血糖水平明显高于对照组（F=266.33,q=31.27～34.19,P0.001），尿量明显高于对照组4（F=561.03,q=37.47～56.20,P0.001），体质量明显小于对照组（F=527.37,q=37.00～49.12,P0.001）见表 1 2.3 各组视网膜组织形态学变化 光学显微镜下每只眼球计数 10 张后极部视网膜神经节细胞数目，每只眼球测量10 张后极部视网膜厚度实验组大鼠视网膜组织较正常对照组大鼠视网膜组织各层厚度变薄，视细胞数目随月龄增加而逐渐减少（图 1～3）实验组大鼠视网膜神经节细胞数目与对照组比较，1 个月组差异无显著意义（t=0.99，P0.05）；3、6个月组差异有显著意义（t=10.28、47.15,P＜0.001）。

见表 2表 1 各组大鼠血糖、24 h 尿量和体质量情况比较表 2 各组大鼠视网膜神经节细胞数目 2.4 视网膜毛细血管超微结构改变 对照组视网膜毛细血管由内皮细胞、周细胞和基底膜构成，内皮细胞位于管腔面，外侧有连续的基底膜和周细胞包绕，内皮细胞和周细胞内异染色质分布均匀，细胞器、细胞核形态正常（图 4）DM1 组毛细血管内皮细胞及周细胞核膜轻微凹陷，异染色质聚集靠边，管腔未变形（图 5）DM3 组内皮细胞水肿，胞质内饮胞增多，线粒体肿胀，核染色质聚集、靠边，管腔变形不显著;周细胞线粒体肿胀，嵴消失;毛细血管基底膜增厚，电子密度明显增大（图 6）DM6 组内皮细胞肿胀变形，核染色质凝聚靠边，核变形，线粒体明显肿胀，并见空泡变性;基底膜增厚显著，电子密度增加;内皮细胞的胞质向管腔内指状突起，管腔明显狭窄，甚至闭塞（图 7） 2.5 视网膜视细胞超微结构改变 正常大鼠视网膜视细胞外节膜盘结构清晰，排列整齐且平行，内节椭圆体内线粒体沿周边排列，结构正常；外核层由视细胞胞体和胞核组成，细胞排列整齐DM1组见膜盘局部模糊不清，间隙略扩大DM3 组膜盘间隙进一步扩大，局部溶解、5断裂（图 8）DM6 组大鼠视细胞外节膜盘间隙扩大明显，结构模糊不清，断裂、溶解，可见空泡，外核层细胞核固缩；内节椭圆体内线粒体水肿，排列不规则（图 9）。

3 讨 论 DR 是糖尿病严重的微血管并发症之一，其发病率高达 38%～90%，成为致盲的主要原因［1,2］，已引起人们广泛重视而目前 DR 的研究多采用动物实验，DR 动物模型是在糖尿病模型上建立起来的常用的实验动物有猴、猫、狗、猪、鼠等，实验动物模型主要分为自发性遗传性动物模型、诱发性动物模型、转基因动物模型［3］建立理想的 DR 实验动物模型是以其疾病的发生、病理变化等方面与人类DR 具有相同或相似的特征为目的，这对于深入探讨人类 DR 的发病机制、病理改变及预防、治疗等有着重要的意义 本实验建立的糖尿病动物模型是诱发性动物模型的一种，使用 STZ 作为化学性诱导剂其作用机制是通过诱导胰腺产生大量的氧自由基从而造成 β 细胞损伤，导致血胰岛素下降和血糖升高，形成胰岛素依赖型糖尿病模型通过一次性腹腔注射均达成模标准，成模率达 100%在实验过程中，糖尿病大鼠在 3 个月组和 6个月组各死亡 1 只，均死于极度消瘦、不能进饮食，死亡率为 4.4%，明显低于相关文献报道的结果［4］，可能与 STZ 使用浓度较低以及对大鼠的周密护理有关 本组糖尿病大鼠视网膜病理组织学观察显示，各层组织变薄、视网膜神经细胞数目减少；视细胞外节膜盘间隙扩大、结构模糊；内节椭圆体内的线粒体水肿、排列紊乱等，证明在糖尿病早期视网膜即有形态学的变化，为 DR 早期病人视功能检查提供了形态学依据。

通过对糖尿病大鼠视网膜微血管超微结构观察显示，视网膜毛细血管内皮细胞水肿，胞质内饮胞增多，线粒体肿胀，核染色质聚集靠边；周细胞线粒体肿胀，嵴消失；毛细血管基底膜增厚，电子密度增加；内皮细胞的胞质向管腔内突起，管腔狭窄，甚至闭塞视网膜微循。