新一代测序技术及其在动物遗传育种中的应用.docx

新一代测序技术及其在动物遗传育种中的应用摘要：随着基因测序技术的进步，新一代测序技术为分子生物学的发展起到了巨 大的推动作用，它的出现使基因测序的成本呈几何级数的趋势下降，并走上大规 模实用化的道路本文综述了新一代测序技术的基本原理、技术路线以及在动物 遗传育种方面的一些应用，并对纳米技术为依托的第三代测序技术的发展提出了 展望关键词：新一代测序技术技术路线动物遗传育种DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了 生物学的发展成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期1977年，Maxam 和Gilberts］报道了通过化学降解测定DNA序列的方法同年，与Gilbert同样获 得诺贝尔化学奖的SangerQ］推出了双脱氧链终止法这两大传统的测序技术以及 在它们基础上发展起来的各种DNA测序技术统称为第一代测序技术，它在分子 生物学的研究中发挥了非常重要的作用，目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧 链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用但随着人类基因组计划的完 成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序方法已经不能满 足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了新一代DNA测序 技术的诞生。

新一代测序技术也称为第二代测序技术，它主要包括罗氏454公司 的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI 公司的SOLID测序平台⑶1第二代测序技术原理1.1 454 GS FLX测序技术原理454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台Genome Sequencer 20，并测序了支原体Mycoplasma genitalium的基因组并在2007年推出性能更 优的第二代基因组测序系统一 GenomeSequencer FLX System(GS FLX)［4］GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，它依靠生物发光对DNA序列进行检 测在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GS FLX 系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来通过检测荧光 信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的此技术不需要 荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高 灵敏度和高自动化的特点1.2 Illumina 公司的 Solexa Genome Analyzer 测序技术原理Solexa测序技术第二代分析系统Genome Analyzer IIx是当前世界上应用最 为广泛的新一代测序系统，较当前普遍使用的一次只能读取1000个左右的碱基， 且DNA样品需要长时间的制备和分析的测序仪，具有高准确性、高通量、高灵 敏度和低运行成本等突出优势。

可以同时完成传统基因组学研究以及功能基因组 学研究为目前遗传分析和功能基因组等研究领域提出了全新的应用方案它的基本原理是所需的文库，可以使用任意能产生数百碱基长、两翼有接头 的片段的方法构建通过PCR桥，反复30轮扩增，每个单分子得到了 1000倍 扩增，成为单克隆DNA簇DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后 杂交在目标区域一侧的通用序列上之后采用边合成边的测序原理进行测序，最 后进行数据分析，自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析1.3 ABI公司的SOLID测序原理Applied Biosystems(AB)公司所开发的 SOLID sequencer 在 2007 年 l0 月开始 商业用途释放SOLID开发的初衷是在已经具有参考序列情况下的重测序与 其他新一代测序仪不同的是，它不是利用DNA聚合酶在合成过程中读取序列， 而是利用DNA连接酶在连接过程读取序列［5］ABI SOLiDTM 4.0采用边连接边 测序的原理，用结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板，以四色荧光标记 寡核苷酸进行连续的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行大规模高通量测 序SOLIDTM 4.0系统采用双碱基编码的方法使得其准确度可以达到99.94% 以上。

2新一代测序技术技术路线l)NA嶂极交面制备• gm■配塞未酷■片段肉元＞共价统^共价—八片段单分子扩喈■ »®PCR■ DNA 簇■光学图镣采集与处理■荧光■化学发光■并行测障反应,磁基薛图 1[6] ( 技术来解决生物学问题比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头 测序(de novo sequencing)，获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠 定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序(resequencing)，在全基因 组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础在转录组水平上进行 全转录组测序(whole transcriptome resequencing)，从而开展可变剪接、编码序 列单核苷酸多态性(cSNP)等研究；或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing)，通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA 分子在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉 淀(MeDIP)技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因 组上的甲基化位点3.1转录组分析第二代测序技术可对单个细胞样品中的所有RNA即整个转录组进行整体测 序，对每个细胞中表达1—50000个拷贝mRNA的基因都能够检测，该技术还可 以检测以前没发现过的基因或新的转录本(transcript)，定量测定基因的表达模式 [7】。

如Mortazavi[8】等人利用Solexa技术对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了 RNA 测序，对测得的每条序列进行计数从而获得每个特定转录本的表达量，能检测到 丰度非常低的转录本分析测得的序列，至少有3500个基因拥有不止一种剪切 形式，其中有接近10%是从未被报道过的RNA的剪切形式3.2重测序如果对照一个参考基因组，新一代测序技术可以短时间内非常轻松的完成一 个基因组的重测序2008年Hillier［9］对线虫CB4858品系进行Solexa重测序，寻 找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增但是也应该看到，由于高 通量测序读取长度的限制，使其在对未知基因组进行从头测序(de novo sequencing)的应用受到限制，这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 个碱基)的协助但是这并不影响高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱、 microRNA表达谱、ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用3.3基因组图谱2009年12月，我国科研人员又在Nature在公布了大熊猫基因组精细图谱 研究成果［10］，表明大熊猫基因组大小2.4G，重复序列含量36%，基因2万多个， 且经过二倍体测序，证明大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断其具有 较高的遗传多态性。

3.4转录调控研究(ChIP-seq)染色体免疫共沉淀(chromatin immun即recipitation，ChIP)技术是研究蛋白与 DNA相互作用的重要方法以往的研究需结合芯片技术(即ChIP-on-chip或 ChIP-chip)，因为芯片技术基于杂交原理，需根据已知的序列设计探针，对于未 知的序列无能为力把ChIP技术和第二代测序技术结合，即 ChIP-sequencing(ChIP-seq)，可以在基因组水平上很方便的检测某种蛋白所结合 的DNA序列，全面了解蛋白与DNA的相互作用现通过Illumina公司的测序 平台就可以对染色质免疫共沉淀得到的微量DNA片断进行大规模测序［11］首先 将获得的DNA片段加上接头后进行PCR扩增得到ChIP-Seq文库后直接进行大 规模测序，并能把所检测蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上如2009 年Ouyang［12］等H引利用ChIP-seq技术发现，在小鼠胚胎干细胞中，大约有65% 的基因表达是由12个转录因子调控的3.5甲基化测序甲基化影响X染色体失活、基因组印迹等表观遗传现象，目前基因的甲基 化异常的检测已成为探讨表观遗传现象的分子研究热点。

过去，检测甲基化的研 究方法通量都较小，限制了对甲基化在基因组水平的深入研究而新一代测序可 以应用到甲基化的检测，通过对5’-甲基胞嘧啶抗体富集的高甲基化的DNA片段 进行高通量测序，可以获得全基因组范围内高精度的甲基化状态，为表观遗传调 控分析提供可靠的证据2010年，我国研究人员借助Illumina的高通量测序技 术获得家蚕基因组甲基化图谱，同时证明了对低甲基化水平的生物个体进行表观 遗传基因测序的可行性［134展望DNA测序技术经过了 30多年的发展，新一代测序技术解决了第一代测序技 术存在的一些难题，然而在遗传学中，成千上成的基因组需要测出及分析，高通 量的第二代测序技术还是面临着成本高、效率低、准确度不够等难题，第三代测 序技术已经开始崭露头角第三代测序技术主要是以纳米技术为基础的单分子测序技术，它的基本原理 是利用合成测序理论，将样本DNA数以百万的单链分子绑定在该仪器特有的、 没有背景荧光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸和聚合酶到单分子阵列 中，核苷酸会结合到DNA分子上特异性结合的位点上用激光激发结合在DNA 分子的荧光标记的核苷酸，使标记物发出荧光，相机以15ms速度快速扫描整个 阵列，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。

在些之后，结合的核苷酸对 会被移动除去，然后，通过重复加入标记的核苷酸来重复这一过程它的一个非 常重要的优势就在于它不需要扩增建立DNA库，从而可以切断了数据结果中潜 在错误的来源因此我们有理由相信第三代测序技术会在不久以后将可以用于大 规模化应用中，为人类以及动物遗传学研究创造更大的空间参考文献：[1] Maxam AM,Gilbert W.A new method for sequencing DNA.Proc Natl Acad Set USA.1977,74(2):560-564.[2] Sanger, F, S. Nicklen and A.R. CoulsonDNA sequencing with chain -terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A.1977,74(12): 5463-5467.[3] Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing . Nat Biotechnol, 2008, 26(10)： 1135-1145.[4] 解增言，林俊华，谭军，舒坤贤.DNA测序技术的发展历史与最新进展.生物技术 通报.2010,8:64-70.[5] 周德贵，赵琼一，付崇允等.新一代测序技术及其对水稻分子设计育种的影响. 分子植物育种.2008,6(4),619—630.[6] Morozova,Hirst M,Marra MA.Applications of new sequencing technologies for transcriptome analysis. Annu Rev Genomics Hum Genet,2009,10:135-151.[8] Mortaz。