Gateway载体构建系统.ppt

GatewayGateway载体构建系统载体构建系统主要内容主要内容•什么是Gateway技术•Gateway克隆原理克隆原理•Gateway技术的特点•Gateway技术的改进与发展为什么要构建为什么要构建Gateway载体系统？载体系统？•传统的酶切连接方法的缺陷传统的酶切连接方法的缺陷 1、需要繁琐的酶切连接，工作量大，难 以满足大规模克隆的需要 2、往往难以找到合适的酶切位点而面临诸多的技术困难，影响实验的效率 Gateway克隆（通路克隆）克隆（通路克隆） Gateway克隆技术是一个高效的大规模克隆系统，由Invitrogen公司开发该技术利用λ噬菌体的位点特异性重组(λ噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶原途径之间的互相转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时还保持正确的ORF和插入方向•基于基于λλ噬菌体位点特异性的重组主要涉及两个成噬菌体位点特异性的重组主要涉及两个成分：分： 1、DNA重组序列 即att位点（包括att B 、att P 、att L 、att R） λ重组反应就是发生在这些特异的att位点上，重组反应中交换位点实际上只是发生在两个位点核心的15bp同源区域，不过核心外围的序列也是不可或缺的，它们含有重组蛋白的结合位点。

2、介导重组反应的蛋白（克隆酶混合物） BP克隆酶混合物：λ噬菌体整合酶（Int）、大肠杆菌整合宿主因子（IHF） LR克隆酶混合物：λ噬菌体整合酶（Int）、切除酶（Xis）、大肠杆菌整合宿主因子（IHF）Gateway克隆原理克隆原理Gateway技术由两个基本反应组成： BP反应 LR反应 通过BP反应(attB×attP)得入门克隆(Entry clone)后，再通过LR反应(attL×attR)将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上(Destination vector).其基本过程可以表示为:attBXattP←→attLXattRBP反应 BP BP 反应是利用反应是利用BP BP 克隆酶混和物催化一个带有克隆酶混和物催化一个带有 attB attB 位点的位点的 DNA DNA 片段或表达克隆和一个带有片段或表达克隆和一个带有attP attP 位点的供载体位点的供载体 ( donor ( donor vector) vector) 之间的重组反应，把目的片段及其两端部分位点转移之间的重组反应，把目的片段及其两端部分位点转移至供载体中，创建一个入门克隆，至供载体中，创建一个入门克隆，其结构为其结构为 attL1- attL1-基因基因-attL2-attL2。

同时，供载体中的同时，供载体中的 ccdB ccdB 细胞死亡控制基因及其两端部分位点细胞死亡控制基因及其两端部分位点被置换出来，单独或融合到表达载体中而形成副产物被置换出来，单独或融合到表达载体中而形成副产物LR反应 LR LR 反应是利用反应是利用 LR LR克隆酶混和物催化一个带有克隆酶混和物催化一个带有 attL attL 位点的入门位点的入门克隆和一个带有克隆和一个带有 attR attR 位点的目的载体之间的重组反应，使目的位点的目的载体之间的重组反应，使目的片段及其两端部分位点取代目标载体片段及其两端部分位点取代目标载体( destination vector) ( destination vector) 的的 ccdB ccdB 基因及其两端部分位点而产生最终的表达克隆，其基因及其两端部分位点而产生最终的表达克隆，其结构为结构为 attB1-attB1-基因基因-attB2-attB2副产物为带有副产物为带有 attP attP 位点的供载体位点的供载体首先首先LRLR克隆酶识别克隆酶识别attLattL和和attRattR位点，然后在载体的融合一分解、位点结构重新分配过程中，位点，然后在载体的融合一分解、位点结构重新分配过程中，入口克隆入口克隆(Entry clone)(Entry clone)中的目的基因及其两头的黑色部分中的目的基因及其两头的黑色部分attLattL位点位点, ,取代目标载体取代目标载体(Destination vector)(Destination vector)的的ccdBccdB基因及其两头的灰色部分基因及其两头的灰色部分attRattR位点，形成表达克隆位点，形成表达克隆(Expression clone)(Expression clone)。

此时，紧靠目的基因的黑色部分此时，紧靠目的基因的黑色部分attLattL位点与远离位点与远离ccdBccdB基因的黑色部基因的黑色部分分attRattR位点重组，形成位点重组，形成attBattB位点位点; ;余下的灰色部分重组形成余下的灰色部分重组形成attPattP位点 BP BP反应与反应与LRLR反应相反应相反，重组蛋白组成的反，重组蛋白组成的BPBP克隆酶混和物催化表达载体克隆酶混和物催化表达载体attBattB间的目的基因转到供载体中，形成间的目的基因转到供载体中，形成新的人口克隆，此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体新的人口克隆，此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体 上下游引物中分别加入attB序列，产物与含有attP位点的载体重组，进行PCR产物的直接克隆Gateway技术的特点技术的特点1 1、可以、可以快速快速而而高效高效的实现的实现DNADNA序列在多种载体序列在多种载体系统的转移，同时系统的转移，同时保证正确的方向和阅读框保证正确的方向和阅读框2 2、对载体和宿主、对载体和宿主没有依赖性没有依赖性3 3、可使用并表达来自、可使用并表达来自多种类型多种类型的的DNADNA序列，如序列，如PCRPCR产物、产物、cDNAcDNA克隆、酶切片段等。

克隆、酶切片段等4 4、适合于将大量的、适合于将大量的DNADNA序列转移到各种序列转移到各种不同的不同的表达载体表达载体上5 5、、系统通用系统通用可以通过添加可以通过添加GatewayGateway盒轻易地盒轻易地将自己感兴趣的载体改造成将自己感兴趣的载体改造成GatewayGateway目的载体目的载体Gateway克隆技术的改进与发展克隆技术的改进与发展•Gateway载体引进ccdB基因作为重组克隆的负筛选，有效地避免传统酶切连接中由于自连载体的转化等因素造成的假阳性现象，大大提高了筛选效率，但由于ccdB基因是毒性基因，所以限制了其在实验室之外其他领域的应用•Invitrogen 公司对 Gateway 克隆系统进行改进, 形成了 N-和 C-端 Gateway 克隆系统即利用 PCR 技术分别扩增两个片段, 这两个片段的N-端和C-端分别含有attB1和attB2位点, 而他们的C-端和N-端含有一段相同的序列这样当与含有attP1和attP2的载体混合后, 在attB和attP之间发生位点特异性重组,而在两个PCR 产物之间发生同源重组这样就使两个片段与载体构建成一个含有嵌合基因的质粒。

•于2004年推出的Rec-Join 专利克隆技术是对 Gateway技术的一个发展即目的基因与目的载体的结合处一端采用 Gateway重组的方法：即目的载体一端保留attR位点; 另一端采用经典克隆的方法，即另一端 attR位点被替换成酶切位点的序列，克隆的步骤大致为“酶切 － 连接 － 重组” Thanks!结束结束。