小鼠脑组织病理总结.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,小鼠脑组织病理实验总结,内容,石蜡切片的制作,冰冻切片的制作,免疫组化,免疫荧光,HE,病理相关试剂配制,注意事项,石蜡切片的制作,取材和固定：处死动物后或者灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中脱水和透明：梯度酒精和二甲苯,浸蜡和包埋：石蜡,切片制作：切片,贴片：捞片，展片,保存：烤片,冰冻切片的制作,取材和固定：灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻脱水和透明：梯度蔗糖,包埋：,OCT,，,3%,聚乙烯醇切片制作：切片,贴片：直接贴,固定：冰冻丙酮,3-5,分,保存：,-20C,灌注,0.5%,戊巴比妥钠,100mg/Kg,麻醉小鼠，,5,分钟左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用酒精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部肌肉层，剑突上成,V,型剪开胸廓，暴露心脏，剪掉右心耳（即视野下心脏上色暗红组织），与心尖处,30,角刺入左心室，,37,左右生理盐水约,10ml,缓慢注入，冲净血液止，换,4%,多聚甲醛溶液（,4,预冷），,10-20,分钟，鼠僵硬为好固定,4%,多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切片的固定时间不同，几小时到一周。

我曾用过,2,天，可以冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预防甲醛沉积取脑,断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑区组织，厚,3mm,左右脱水和透明，浸蜡,石蜡切片：,75%,，,80%,，,85%,，,90%,，,95%,（,2,个），无水乙醇（,2,）中每个,4,小时,-,过夜，正丁醇,1-2,天二甲苯（,2,个）,20-30,分钟三个蜡，每个大于,2,小时冰冻切片：固定后脱水用,10%20%30%,蔗糖（,0.1MPBS,溶）每个室温下,4,小时,过夜，,OCT,包埋，先在锡纸盒冻一层，在中间放组织，切面朝下，再用,OCT,将组织没过，尽量减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平，待中心尚透明时取出，放于,-80C,保存切片,石蜡：冷水,温水（,54-56,）,烤片（,80,）,切好烤片后可以室温保存冰冻：切片温度,-18-20,直接贴,切好于冰冻丙酮中固定,5,分后,-20,保存固定方法注意事项,1.组织块大小2cmx2cmx0.5cm,2.组织标本应及时放入固定液中,切忌干涸,3.组织固定后必须冲洗,除去多余的固定液,4.一般固定剂温度以室温,某些病毒则须低温,下处理,用丙酮-20度至-40度固定30分钟,5.浓度采用10%中性甲醛或4%多聚甲醛,6.,固定液量是标本体积,20倍,7.固定时间不超过24小时,组化实验设计,1.对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织标本,2.列出免疫组化的指标,3.进行预实验(设立阳性、阴性对照),4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育温度及孵育时间,5.每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆,实验过程,70,考片一夜,二甲苯,3,个每个,10,分钟无水乙醇，,95%,，,90%,，,85%,，,80%,每个,10,分钟,3%,双氧水阻断室温,10,分钟（现配现用）,抗体修复液（现配，,400ml,一次一个抗体盒）,微波炉高火,6-7,分,冷却至室温,再修复一次冷却,PBS5,分,3,擦片加一抗，,4,过夜,第二日,PBS5,分,3,加二抗 室温,20,分,PBS5,分,3,DAB,显色,水冲,5-10,分,苏木素,1-3,分,水冲,10-15,分,80%85%90%,每个,3,分,95%,（,2,个）无水乙醇（,2,个）二甲苯（,2,个）每个,5,分,中性树胶封片。

免疫荧光,PBS5,分,3,5%BSA,室温封闭,1,小时,加一抗，,4,过夜或根据说明书时间,第二日,PBS5,分,3,加二抗,37,孵育,1,小时,PBS5,分,3,DAPI,染色,PBS2,分,丙三醇封片荧光显微镜下观察照相HE,70,烤片一夜,二甲苯,3,个每个,10,分钟无水乙醇，,95%,，,90%,，,85%,，,80%,每个,5,分钟,苏木素,1-5,分,水,盐酸酒精,水,0.5%,氨水,水,95%,酒精,2,分,0.5%,醇溶伊红,1,秒,95%,酒精,30,秒,95%,酒精，无水乙醇（,3,个）每个,2,分,二甲苯（,2,个）每个,2,分钟,中性树胶封片，吹干,病理相关试剂配制,4%,多聚甲醛：,40g,多聚甲醛粉末溶于,500ml,水（,50,左右）黄枪头加一滴,1M,氢氧化钠至澄清，冷却至室温，与,500ml0.2MPBS,混合，滤纸过滤0.2MPB:1000ml,0.2M,磷酸氢二钠,810ml,称,57.996g,0.2M,磷酸二氢钠,190ml,称,5.928g,蔗糖：用,0.1MPBS,配制,生理盐水：,0.85%,氯化钠溶液,阻断液：,0.3%H2O2,甲醇溶液。

30%,双氧水,2ml,加入甲醇定容至,200ml,现用现配）,修复液：（,400ml,）,柠檬酸,0.16g,柠檬酸钠,1.18g,苏木素：,100g,硫酸铝钾加热溶于,1250ml,水中,5g,苏木素精粉末溶于,100ml,无水乙醇中,溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶苏木素煮沸,20-30,分，加入,g,氧化汞煮沸,2,分钟，,注意事项,安全,解剖位置,液体配制,染色时间,原因查找,Thank you!,。