IL18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM体外增殖及体内成瘤的影响.doc

1IL18 基因转染对小鼠卵巢癌 OVHM 体 外增殖及体内成瘤的影响作者：崔澂, 郝淑维, 李新伟, 白小嘉, 程建新, 单保恩【摘要】 目的: 分析转染 IL 18 基因后, 对小鼠卵巢癌 OVHM 细胞体外增殖、 凋亡及体内成瘤的影响, 初步探讨 IL 18 基因转染治疗卵巢癌的应用价值方法: 将逆转录病毒携带的小鼠 IL 18 基因成功转染至 OVHM（OVHM/IL 18）, 以空载体转染的 OVHM（OVHM/LXSN）和野生型（OVHM）作为对照分别采用 MTT、 FCM 检测体外培养细胞的增殖、 凋亡及周期分布于裸鼠皮下分别接种细胞, 观察各组种植瘤生长情况, 计算成瘤率; RT PCR 检测瘤组织中 IL 18 mRNA 表达; FCM 和电镜分析肿瘤细胞增殖、 凋亡状况结果: 3 组细胞的体外增殖未见明显差异, 均无明显凋亡现象, 增殖指数、 细胞周期分布均无明显差异（均P0.05）接种后, 3 组裸鼠的成瘤率相同, 但 OVHM/IL 18 组成瘤时间较晚, 随瘤龄增长肿瘤生长缓慢, 瘤组织中 IL 18 mRNA 阳性表达OVHM/IL 18 组裸鼠种植瘤细胞可见典型的凋亡现象, G0/G1 期细胞明显增多, S 期细胞明显减少, 增殖指数明显降低, 凋亡指数明显增高（P0.01）。

结论: IL 18 基因成功转染后, 虽对体外卵巢癌细胞无直接毒性, 但可能在体内借助非直接杀伤的其他途径, 通过阻断细胞周期、 促进肿瘤细胞凋亡等抑制体内成瘤 【关键词】 IL 18 基因转染 OVHM 增殖 凋亡 成瘤［Abstract］ AIM: To investigate the effects of IL 18 gene transfection on proliferation, apoptosis and tumorigenesis of mouse ovarian cancer cell line OVHM. METHODS: OVHM were transfected with retrovirus encoding IL 18 gene (OVHM/IL 18). The wild OVHM and OVHM transfected with vector without IL 18 2gene (OVHM/LXSN) were enrolled as the controls. The proliferation, cell cycle and apoptosis were measured by MTT and FCM respectively. The nude mice were subcutaneously inoculated with the three different cells respectively. The observation of transplanted tumor’s growth and calculation of tumorigenesis ratio was made. The expression of IL 18 mRNA in tumor tissues was detected by RT PCR, and the apoptosis of tumor cell in tissue was analyzed by electron microscope and FCM. RESULTS: The three cells cultured in vitro showed no apoptotic peaks, and no differences in proliferation and cell cycle (All P0.05). Following inoculation, the ratios of tumorigenesis were similar in all the three groups. But in OVHM/IL 18 group, the latent period of tumorigenesis was longer with slower tumor growth rate and positive expression of IL 18 mRNA in tumor tissue. It was also observed that in the tumor cells from nude mice inoculated by OVHM/IL 18, the cells in phase of G0/G1 increased with typical morphology of apoptosis, and those in S phase decreased with decreased proliferation index and increased apoptosis index (All P0.01). CONCLUSION: Although IL 18 gene has no cytotoxic effects in vitro, its inhibiting effects on tumorigenesis of OVHM in vivo were exerted by interdicting cell cycle and accelerating apoptosis of tumor cells.［Keywords］IL 18; gene transfection; OVHM; proliferation; apoptosis; tumorigenesisIL 18 是 1995 年发现的具有抗瘤作用的重要免疫调节因子［1］; 卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一, 死亡率位居女性生殖系统肿瘤首位［2］。

研究证实,随着卵巢组织从正常向良性及恶性肿瘤的转变, 组织中 IL 18 mRNA 及蛋白表达递减直至缺如［3］提示, 若将 IL 18 基因导入卵巢癌细胞, 纠正其缺陷表达, 则可能有效诱导 IL 18 的抗瘤效应因此, 我们研究了 IL 18 基因成功转染至小鼠卵巢癌 OVHM 细胞后, 对体外肿瘤细胞的直接杀伤及体内成瘤的影响, 初步探讨将IL 18 基因作为优选靶对卵巢癌进行基因治疗的可行性1 材料和方法1.1 材料 OVHM 由日本大阪大学医学院 Hiromi Fujiwara 博士惠赠; 由逆转录病毒作为载体携带小鼠 IL 18 基因的 PA317/IL 18、 携带空载体的PA317/LXSN 细胞均由日本千叶县癌症研究中心田川雅敏先生惠赠4～6 周龄3BALB/c/nu 雌性裸鼠（18～20 g）由中国药品生物制品鉴定所（SCXK(京)2000 0010）提供G418、 polybrene 为美国 AMRESCO 公司产品; EB、 MTT 为Sigma 公司产品; TRIzol 为美国 Gibco 公司产品; RT PCR 试剂盒为华美生物工程公司产品; β actin、 IL 18 引物序列查自 GenBank, 经 Premier5.0 软件分析核对, 由上海生工生物技术有限公司合成。

ABI5700 型 PCR 循环仪为美国 ABI 公司产品; FOTODYNE60 2107 型凝胶成像分析系统为美国 Image 公司产品; H 500型透射电镜为日本日立公司产品; Mk353 型酶联免疫检测仪为芬兰ThermoLabsystems 产品; Vantage 流式细胞仪为美国 BD 公司产品1.2 方法1.2.1 小鼠 IL 18 基因转染 OVHM 细胞 分别取达 80%融合的 PA317/IL 18及 PA317/LXSN 细胞, 培养 24 h 后收集病毒原液上清; 取对数生长期 OVHM, 将 2×105 个细胞接种于 6 cm 培养皿中, 24 h 后弃去上清, 加入病毒原液上清及新鲜培液各 1 mL, 并加入 polybrene（终浓度为 8 mg/L）培养 3 h 后, 补加培养液稀释的 polybrene 至 2 mg/L, 再培养 24 h以终浓度 400 mg/L 的 G418 进行阳性克隆筛选, 200 mg/L G418 维持逐步扩大培养, 20 d 后分别获得转染小鼠 IL 18 的OVHM/IL 18 和空载体转染 OVHM/LXSN 细胞[4]。

最后经 IL 18 mRNA 及蛋白合成、 分泌的检测, 鉴定转染成功1.2.2 细胞体外生长增殖、 凋亡状况的检测 将细胞密度调至 2.5×107/L, 于96 孔板分别培养 1～6 d, 观察细胞形态、 折光性及贴壁生长等情况培养结束前 4 h, 每孔加入 5 g/L MTT20μL; 培养结束后离心弃上清, 每孔加入DMSO150μL, 振荡 10 min, 酶联免疫检测仪检测 A570 值调整细胞密度为41×109/L, 加入 5 g/L 胃蛋白酶, 37℃孵育 30 min 后离心弃上清; 加入 50 mg/L EB染液, 4℃ 30 min, 500 目铜网过滤后上机检测在 DNA 含量直方图上观察凋亡峰是否出现, 计算凋亡指数（apoptotic Index, APOI）=（凋亡细胞数/所测细胞总数）×100%; 应用 DNA 细胞周期分析软件计算各时相百分比, 以增殖指数（proliferation index, PI）表示细胞增殖活性, PI=［(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)］×100%1.2.3 荷 OVHM 肿瘤小鼠模型的建立及成瘤观察 实验裸鼠于 SPF 层流室中恒温、 恒湿（45%～50%）环境饲养, 所用垫料、 饮水、 饲料等均经高压灭菌处理。

将 15 只 BALB/c/nu 裸鼠随机分为 3 组: OVHM/IL 18 组, OVHM/LXSN 组（空载体对照）, OVHM 组（野生型对照）, 每组各 5 只分别取对数生长期的细胞, 于裸鼠右前肢皮下接种（2×106 个/只）每日观察小鼠的饮食、 活动等一般状况及肿瘤生长情况游标卡尺测量瘤体的长径（a）与短径（b）, 计算测量当日的肿瘤体积: V=a×b2/2于接种后 4 周末处死, 完整剥离肿瘤, 称取瘤重, 计算成瘤率1.2.4 荷瘤小鼠肿瘤组织的形态学观察 瘤组织经 100 mL/L 福尔马林固定, 常规石蜡包埋切片后 HE 染色观察另一部分瘤组织, 经 40 mL/L 戊二醛 锇酸双重固定、 脱水、 浸透、 包埋、 聚合、 切片、 染色后, 透射电镜下观察1.2.5 荷瘤小鼠肿瘤组织中 IL 18 mRNA 表达的检测 β actin 引物为 p1: 5′ GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AG 3′, p2: 5′ TTG TAA CCA CCT GGG ACG ATA TGG 3′, 扩增长度 764 bp; IL 18 引物为 p1: 5′ ATC CCT CGA GAT GGC TGC CAT GTC AGA AGA C 3′, p2: 5′ GCC CAC GCG TCT AAC TTT GAT GTA AGT TAG T 3′, 扩增长度 599 bp。

TRIzol 试剂分别提取瘤组织中的总 RNART PCR 总反应体系（30 μL）为: RT PCR 酶混合物 2 μL, 20×缓冲液51.5 μL, dNTP 1.2 μL, MgCl2 2.0 μL, p1、 p2 各 1 μL, 总 RNA 2 μg混匀后于 PCR扩增仪进行基因扩增IL 18 扩增参数为, 37℃反转录 50 min, 94℃ 5 min; 94℃ 50 s, 55℃ 50 s, 72℃ 50 s; 35 个循环后 72℃ 10 minβ actin 扩增参数为, 37℃反转录60 。