实验四沉淀反应陈兆云.ppt

实验四实验四沉淀反应双向扩散与免疫火箭电泳实验课重点掌握：1.双向免疫扩散实验手工操作过程2.火箭电泳原理及影响因素熟悉：1.双向免疫扩散实验结果分析2.火箭电泳实验操作过程实验一、双向扩散实验实验一、双向扩散实验 原理：将抗原抗体原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖分别加在琼脂糖不同的对应孔中，不同的对应孔中，两者在凝胶中自两者在凝胶中自由扩散，在比例由扩散，在比例合适处形成白色合适处形成白色沉淀线 技术要点：平板玻璃上倾注一层均技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为径为3 3mmmm，，孔间距在孔间距在3 3～～5 5 mmmm之间，之间，在相对的孔中加入在相对的孔中加入10ul10ul血清与抗血血清与抗血清，放置湿盒清，放置湿盒37℃1837℃18～～2424h h 后，观后，观察孔周围是否出现沉淀环察孔周围是否出现沉淀环鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平板法）试剂与器材1.抗原：人血清2.抗体：抗人IgG血清3.生理盐水（1：2~1：64系列倍比稀释）4.用生理盐水和琼脂粉配成1.1%的琼脂5. 5*5cm的洁净培养皿6.水浴箱，锥形瓶，打孔用小吸管移液器和酒精灯等实验一主要步骤 琼脂加热 制琼脂板 37度24小时 打梅花孔 加血清与抗血清 观察结果应用应用1.1.抗体效价的滴定抗体效价的滴定 2.2.抗原或抗体纯度抗原或抗体纯度的鉴定的鉴定 双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平板法）实验一注意事项1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在1~1.5mm（视线要在平皿侧面观察）。

2.打孔时要等琼脂完全冷却后，垂直打孔3.用针挑去孔内琼脂时要小心损伤孔边缘4.孔内加样要准确，不得使加样头碰到琼脂孔边缘5.平皿要始终水平操作结果分析A.AgA.Ag、、AbAb浓度及分子量相近；浓度及分子量相近；B. AgB. Ag、、AbAb浓度相近，分子量浓度相近，分子量AgAb;D.Ag>Ab;D.浓度浓度Ag>Ab,Ag>Ab,分子量相近分子量相近; ;E.E.浓度浓度Ag>Ab,Ag>Ab,分子量分子量AgAbAg>Ab电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。

原量呈正相关 原理原理单向免疫扩散＋电泳单向免疫扩散＋电泳, ,定量检测技术定量检测技术实验二、火箭免疫电泳实验二、火箭免疫电泳试剂与器材1.抗原：人血清2.抗体：抗人IgG血清3. 水浴箱，锥形瓶，移液器等4.琼脂糖电泳槽5.PH8.6巴比妥缓冲液实验二主要步骤PBS混合琼脂55℃ +抗血清 制琼脂电泳玻璃板 电泳槽加PH8.5PBS 取点样梳 电泳5~6小时 梳井内加血清 观察结果PH8.6PH8.6的巴比妥琼脂糖约的巴比妥琼脂糖约55℃55℃，加入，加入适量抗血清，混匀后制板，凝固后适量抗血清，混匀后制板，凝固后取下点样梳，在梳井孔内加取下点样梳，在梳井孔内加10ul10ul标标准血清及待测样品血清，准血清及待测样品血清，梳井梳井样品样品孔放负极侧，孔放负极侧， 电泳仪调节电势梯度电泳仪调节电势梯度5~6V/cm5~6V/cm，电流，电流3~4mA3~4mA，电泳，电泳5~6h5~6h后后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。

线，求出待测样品浓度技术要点技术要点火箭免疫电泳火箭免疫电泳1.1.1.1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则2.2.2.2.电泳终点时间的确定电泳终点时间的确定电泳终点时间的确定电泳终点时间的确定3.3.3.3.标本数量多时应先通电后加样标本数量多时应先通电后加样标本数量多时应先通电后加样标本数量多时应先通电后加样, , , ,防止宽底峰防止宽底峰防止宽底峰防止宽底峰形形形形. . . .4.IgG4.IgG4.IgG4.IgG相反方向的电渗作用相反方向的电渗作用相反方向的电渗作用相反方向的电渗作用5.5.5.5.加样和琼脂中抗血清的浓度加样和琼脂中抗血清的浓度加样和琼脂中抗血清的浓度加样和琼脂中抗血清的浓度 影响因素影响因素火箭免疫电泳火箭免疫电泳　　　　火箭免疫电泳图　　　　火箭免疫电泳图①②③④①②③④为标准抗原；为标准抗原；⑤⑥⑤⑥为标本为标本- -+ +火箭免疫电泳示意图火箭免疫电泳示意图定量结果判断1.将待测电泳峰高度与1、2、3标准浓度血清对比得出浓度。

2.将标准血清浓度与峰值高度绘制曲线图，根据待测电泳峰高度，查处相应浓度实验二注意事项1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在1~1.5mm，倒满整个玻璃挡板范围内2.要等琼脂完全冷却后，先从一侧慢慢取下点样梳3. 加样要准确，要加到梳井孔内4.悬空加样，通电后不得用手触及电泳环境中的缓冲液5.电泳一段时间后注意观察火箭沉淀现象火箭电泳应用的意义 火箭电泳作为抗原定量只能测定ug/ml以上的含量，低于此水平则难以形成可见的沉淀峰，若是使用少量125125I标记抗原或抗体，即使含量低火箭峰不可见也可使用X线胶片显影的技术显示火箭峰，测出ng/ml的含量浓度思考题火箭电泳实验结果不好,常会有哪些影响因素,分别造成什么样的电泳图? 实验报告实验一实验一1.1.实验报告标准格式实验报告标准格式2.2.梅花孔图文描述（抗原与抗体复合物位置、形状梅花孔图文描述（抗原与抗体复合物位置、形状及代表意义；抗体效价浓度比例）及代表意义；抗体效价浓度比例）实验二实验二1.1.实验报告标准格式实验报告标准格式2.2.火箭形状描述，失败或结果不好的原因火箭形状描述，失败或结果不好的原因3.3.定量结果（与定量结果（与3 3个标准血清峰比较大致含量）个标准血清峰比较大致含量）以上均以书面和图形表示在实验报告中以上均以书面和图形表示在实验报告中实验标本分类实验一1.美国贝克曼羊抗人血清igG试剂（每个大试验台2支子弹头）共8支2.人血清标本（每个大试验台2支子弹头）共8支3.5*5平板每人一个共56个4.打孔吸管和挑取针（每个大试验台3附）5.琼脂锥型瓶4个（每个大试验台1个）实验标本分类实验二1.人标准血清1，2，3，和标本血清1，2，3，4，5共四份全体实验学生共同配合使用。

2.火箭电泳漕两个，课堂由学生制作电泳琼脂板四个3.四块电泳琼脂板分四个大实验台学生自行加样跑电泳整组统一操作，每组一名组织人。