菌株选育调节.doc

第三章第三章菌株选育调节菌株选育调节优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量 有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种理想的工业发酵菌种应符合以下要求：理想的工业发酵菌种应符合以下要求： (1)遗传性状稳定；遗传性状稳定； (2)生长速度快，不易被噬菌体等污染；生长速度快，不易被噬菌体等污染； (3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物的产量尽可能接近理论转化率； (4)目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离；目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离； (5)尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离； (6)培养基成分简单、来源广、价格低廉；培养基成分简单、来源广、价格低廉； (7)对温度、对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；、离子强度、剪切力等环境因素不敏感； (8)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。

对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法，菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法， 人为引起的菌种遗传变异或基因重组人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等 技术后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段，技术后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段， 定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势当然，菌种选育的前提条件是从自然定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势当然，菌种选育的前提条件是从自然 界获得相应的原始菌种界获得相应的原始菌种3.1 从自然界中获得新菌种从自然界中获得新菌种自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主 要栖居和生长繁殖场所微生物种类大大超过所有动植物之和随着微生物学研究工作的要栖居和生长繁殖场所微生物种类大大超过所有动植物之和。

随着微生物学研究工作的 不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速 而准确的新种分离和筛选方法而准确的新种分离和筛选方法3.1.1 采样采样采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定 具体的时间、环境和目标物具体的时间、环境和目标物 1.采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种可寻找已适应各种环境压力的微采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种可寻找已适应各种环境压力的微 生物类群生物类群 土壤：细菌和放线菌为主；土壤：细菌和放线菌为主； 果园树根土层：酵母菌含量较高；果园树根土层：酵母菌含量较高； 动植物残体及霉腐土层：较多的霉菌；动植物残体及霉腐土层：较多的霉菌； 豆科植物根系土：根瘤菌；豆科植物根系土：根瘤菌； 河流湖泊的淤泥：产甲烷菌；河流湖泊的淤泥：产甲烷菌； 油田和炼油厂周围土层：分解石油微生物。

油田和炼油厂周围土层：分解石油微生物 各种水体：具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物；各种水体：具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物； 污染源附近的土壤、水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放污染源附近的土壤、水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放 线菌或真菌等微生物理想的采样地点线菌或真菌等微生物理想的采样地点 2.采土样方法：用小铲子去除表土，取离地面采土样方法：用小铲子去除表土，取离地面 5～～15cm 处的土样几克，盛于预先灭菌的牛处的土样几克，盛于预先灭菌的牛 皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考 3.1.2 增殖增殖 在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，在培养在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，在培养 基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖 培养或富集培养其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它培养或富集培养。

其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它 们从样品中分离们从样品中分离 培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养）和恒化富集培养（连续培养）培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养）和恒化富集培养（连续培养） 分批式富集培养分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立分批式富集培养分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立 选择性压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌选择性压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌 落 恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制不同菌株的比生长速率恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制不同菌株的比生长速率 3.1.3 菌株的分离菌株的分离 1. 施加选择性压力分离法：分离的效率取决于培养基养分，施加选择性压力分离法：分离的效率取决于培养基养分， pH，加入选择性抑制剂加入选择性抑制剂 大多数放线菌培养基大多数放线菌培养基 pH 在在 6.7~7.5，嗜酸菌，嗜酸菌 pH 在在 4.5~5.0 在分离放线菌和细菌时，可加抗真菌抗生素；分离真菌时，加抗细菌抗生素。

在分离放线菌和细菌时，可加抗真菌抗生素；分离真菌时，加抗细菌抗生素从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100 ℃℃很难杀死，要在很难杀死，要在 121 ℃℃才才 能彻底死亡可先将土样加热到能彻底死亡可先将土样加热到 80 ℃℃或在或在 50％乙醇溶液中浸泡％乙醇溶液中浸泡 1h，杀死不产芽孢的菌种，杀死不产芽孢的菌种 后再进行分离后再进行分离在富集培养基中，加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰在富集培养基中，加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰 阴性菌无作用阴性菌无作用分离厌氧菌时可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电位下降，造分离厌氧菌时可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电位下降，造 成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品中的比例提高，筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品中的比例提高， 从中便于分离到所需的菌株从中便于分离到所需的菌株。

分离放线菌时，在样品悬浮液中加入分离放线菌时，在样品悬浮液中加入 10 滴滴 10％的酚或加青霉素（抑制％的酚或加青霉素（抑制 G+菌）菌） 、链霉素、链霉素 （抑制（抑制 G-菌）各菌）各 30~50U/ml，以及丙酸钠，以及丙酸钠 10 g/ml （抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到 100℃℃ 保温保温 1h，，可减少细菌和链霉菌的数量可减少细菌和链霉菌的数量分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处 理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离马丁氏马丁氏(martin)培养基就是专门用于分离土壤中真菌的选择性培养基其配方是：葡萄培养基就是专门用于分离土壤中真菌的选择性培养基。

其配方是：葡萄 糖糖 1%，蛋白胨，蛋白胨 0.5%，，KH2PO4 0.1%，，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂，琼脂 2%，孟加拉红，孟加拉红(或称或称 虎红虎红)1/3 万，链霉素万，链霉素 30mg/ml，金霉素，金霉素 2mg/ml此处的孟加拉红、链霉素和金霉素等的作此处的孟加拉红、链霉素和金霉素等的作 用是抑制细菌生长，从而富集土壤中的真菌用是抑制细菌生长，从而富集土壤中的真菌 2. 随机分离筛选法随机分离筛选法 一些微生物的产物对生产菌的筛选没有直接的选择性作用，常用随机分离法进行分离一些微生物的产物对生产菌的筛选没有直接的选择性作用，常用随机分离法进行分离 (1) 抗生素生产菌的分离抗生素生产菌的分离将摇瓶培养的过滤液或细胞提取液、混合提取液将摇瓶培养的过滤液或细胞提取液、混合提取液, 用联合试验菌筛选：如黄色霉素抗生用联合试验菌筛选：如黄色霉素抗生 素就是用枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴式梭状芽孢杆菌筛选出的素就是用枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴式梭状芽孢杆菌筛选出的 利用与抗生素作用机制相关的酶筛选：如棒酸利用与抗生素作用机制相关的酶筛选：如棒酸 (2) 药理活性化合物的分离药理活性化合物的分离-体外筛选体外筛选筛选能抑制生物代谢途径中一关键性酶（靶酶或靶标酶）的活性。

筛选能抑制生物代谢途径中一关键性酶（靶酶或靶标酶）的活性抗高血压：用血管紧张素转移酶抗高血压：用血管紧张素转移酶Aspartate Asparagine synthetaseATPGlutamineAMP+PPiGlutamateAsparagineProteinCinmethylin2-hydroxy-1,4-cineole图图 1. 天冬酰胺合成酶催化反应及其除草剂天冬酰胺合成酶催化反应及其除草剂 Cinmethylin 的作用机理的作用机理 (3) 抗肿瘤药物生产菌的分离抗肿瘤药物生产菌的分离利用微生物筛选作用于利用微生物筛选作用于 DNA 的抗肿瘤药物的抗肿瘤药物---具有灵敏度高、简便快速的特点具有灵敏度高、简便快速的特点生化诱导法筛选：采用测定溶原性噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶生化诱导法筛选：采用测定溶原性噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶 活性的方法，即将大肠杆菌的活性的方法，即将大肠杆菌的 lacZ 基因连接在噬菌体的基因连接在噬菌体的 Pl 启动子下，当启动子下，当 DNA 损伤时，损伤时， 诱发阻遏蛋白诱发阻遏蛋白 Cl 分解，分解， Pl 启动子启动启动子启动 lacZ 基因转录，测定表达的半乳糖苷酶活性，来基因转录，测定表达的半乳糖苷酶活性，来 检测能损伤检测能损伤 DNA 的抗肿瘤药物的存在。

的抗肿瘤药物的存在SOS 生色检测法：利用生色检测法：利用 DNA 损伤时，可活化损伤时，可活化 yecA 蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白， 再引起再引起 sifA(sulA)基因启动子启动基因启动子启动 lacZ 基因的表达基因的表达,从而达到检测能损伤从而达到检测能损伤 DNA 的抗肿瘤药的抗肿。