基因的定点突变.pdf

第六章基因突变技术第六章基因突变技术一、传统的诱变一、传统的诱变?利用能够修饰利用能够修饰DNA分子的化学或物 理诱变剂处理生物体分子的化学或物 理诱变剂处理生物体?射线（紫外线、射线（紫外线、X射线、γ射线等）射线、γ射线等）?化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚 硝基胍等）、亚 硝基胍等）第一节基因定点诱变第一节基因定点诱变?不足：不足：?生物体的任何基因都可能发生突变，目 的基因突变率较低，筛选困难生物体的任何基因都可能发生突变，目 的基因突变率较低，筛选困难?即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上?在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质二、基因定点诱变二、基因定点诱变?定点诱变定点诱变（（site-directed mutagenesis):在体外特异性改变某个碱基的技术研究基因的结构与功能的关系获得所需功能的突变体蛋白质在体外特异性改变某个碱基的技术研究基因的结构与功能的关系获得所需功能的突变体蛋白质1. 寡核苷酸盒式诱变寡核苷酸盒式诱变 Cassette mutagenesis利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列EcoRIHindIIIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIEcoRIHindIII突变DNA野生型DNA 野生型DNA人工合成的寡核苷酸片段退火DNA连接酶突变体序列移走小片段HindIII EcoRI野生型DNA2. 寡核苷酸引物诱变寡核苷酸引物诱变①基本原理：①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列作为诱变剂的寡核苷酸序列：作为诱变剂的寡核苷酸序列：?人工合成一段人工合成一段8~18个碱基的寡核苷酸 序列，该序列中除了所需的碱基突变 外，其余的则与目的基因编码链的特定 区段完全互补个碱基的寡核苷酸 序列，该序列中除了所需的碱基突变 外，其余的则与目的基因编码链的特定 区段完全互补?错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位?通常采用化学合成通常采用化学合成②基本步骤：②基本步骤：?将待突变的目的基因插入将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体噬菌体载体 上，制备单链上，制备单链DNA?将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在DNA聚合酶作用下合成互补的双链聚合酶作用下合成互补的双链DNA?将双链将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因转化大肠杆菌，获得突变基因?突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法AGT CGAAAGT CGAATCA GCTGAGT CGAATCA GCTGTCA GCTT AGT CGACTCA GCTGTCAGGCT 化学合成的寡核苷酸野生型突变型单链的 重组分子M13杂交退火DNA聚合酶DNA连接酶转化大肠杆菌 局限性：局限性：突变体子代频率低突变体子代频率低?退火时，有些单链模板退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷酸配对未与寡核苷酸配对?细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成 链中的错配碱基（寡核苷酸引物链未甲基化）细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成 链中的错配碱基（寡核苷酸引物链未甲基化）?50%突变体突变体改进的硫代磷酸诱变法改进的硫代磷酸诱变法（选择突变体单链）有一些限制酶如（选择突变体单链）有一些限制酶如AvaI, NciI, PstI 等无法切割硫代磷酸等无法切割硫代磷酸DNASee moviedut −ung−(or Kunkel) Strand Selection?The dutgene encodes dUTPase whose function is to degrade dUTP?dut−results in an elevated concentration of dUTP within the cell and incorporation of U in place T at some positions during DNA replication?The unggene encodes uracil N-glycosylase, which normally removes uracil from DNA100% mutant strandHiguchi, 1988Four primers, three PCR3. PCR Based MutagenesisAdvantages:?The mutagenesis efficiency is very high?No wild-type DNA present in the final productDisadvantages:?Unwanted mutations may be introduced due to Taq DNA polymerase?Large DNA fragments are difficult to amplify using PCRQuickChange Mutagenesis第二节基因的直接进化技术第二节基因的直接进化技术?Directed evolution （（直接进化直接进化或或定向进化定向进化）对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。

对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，从而实现在试管中分子水平的模拟进化Why directed evolution??Enzymes are optimized and often highly specialized for specific biological functions within the context of a living organism. ?Biotechnology, in contrast, needs enzymes to be stable and active over long periods of time, or active in nonaqueous solvents , or accept different substrates not present in nature ?Protein rational design and DNA recombination can be used to alter the protein properties?But rational design require enormous inputs of structural, mechanistic, and dynamic information.?Directed evolution bypassed the hurdles to the rational design of enzymes What is directed evolution??Directed evolution mimics Darwinian evolution in the test tube, and involves the generation and selection of a molecular library with sufficient diversity for the altered function to be represented. ?Unlike natural evolution, a directed evolution experiment has a defined goal, and the key processes--mutation, recombination and screening or selection--are controlled by the experimenter. Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment?Directed evolution allows us to explore enzyme functions never required in the natural environment and for which the molecular basis is poorly understood. 基因直接进化的步骤基因直接进化的步骤?突变突变 基因突变库的建立基因突变库的建立?筛选筛选 基因突变库的活体或离体筛选基因突变库的活体或离体筛选随机突变的策略：随机突变的策略：1. 易错易错PCR（（error-prone PCR）在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg）在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变2. DNA shuffling （（DNA 重排或改组）重排或改组）DNA shuffling 是指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组。

通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能是指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能Wt gene Error prone PCR or other methodDNase I fragmentationReassemble full length gene by unprimed PCR基本步骤基本步骤:?目的基因片段的准备目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一 个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较 高同源性的基因：根据不同的需要选择一 个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较 高同源性的基因?DNaseI 酶 切酶 切 ： 将 基 因 随 机 切 割 成 约： 将 基 因 随 机 切 割 成 约 50 ～～ 100bp左右的小片段左右的小片段?不加引物的不加引物的PCR：在：在Taq酶的作用下将切割后 的酶的作用下将切割后 的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程 中可能发生许多突变和重组重叠小片段重新连接起来，在这个过程 中可能发生许多突变和重组?加引物的加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物：加入目的基因片段两端的引物,, 使连接好的使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。

得到扩增，筛选正突变基因家族的改组基因家族的改组突变基因的表达与筛选突变基因的表达与筛选?Phage display of random peptidesM13 phage丝状噬菌体M13基因组是单链环状DNA 主要外壳蛋白是基因丝状噬菌体M13基因组是单链环状DNA 主要外壳蛋白是基因VIIIVIII编码的蛋白质 少量外壳蛋白是基因编码的蛋白质 少量外壳蛋白是基因IIIIII、VI、VII和I。