利用crisprcas9系统构建稳定敲除4.1r基因的raw264.7细胞株.doc

利用 CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除4.1R 基因的 RAW264.7 细胞株 王成博 康巧珍 丁聪 李雅雯 梁桃桃 张成龙 王文 王婷 郑州大学生命科学学院 摘 要： 目的 利用 CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除 4.1R 基因的 RAW264.7 巨噬细胞株, 为研究 4.1R 在巨噬细胞中的功能奠定基础方法根据 CRISPR/Cas9 靶向原理设计并合成 3 个特异性识别 4.1R 基因的向导 RNA (sgRNA) , 构建 sgRNAlenti CRISPRv2 重组质粒并转入 293T 细胞中制备 sgRNA-Cas9 慢病毒, 慢病毒侵染RAW264.7 细胞, 嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆, Western blotting印记检测单克隆细胞中蛋白 4.1R 的表达, 测序确认单克隆细胞中突变位点结果 Western blotting 印迹检测结果表明筛选出的 1 株单克隆细胞中蛋白 4.1R的表达完全缺失;测序结果表明该细胞株中 4.1R 基因发生了 19bp 的缺失突变;并且 4.1R 基因敲除后, RAW264.7 细胞的增殖能力显著增加。

结论 本研究利用CRISPR/Cas9 系统成功的干扰了巨噬细胞系 RAW264.7 细胞中 4.1R 的表达, 为研究 4.1R 在巨噬细胞中的功能提供了有效工具关键词： CRISPR/Cas9 系统; 4.1R; 基因敲除; RAW264.7 细胞; 作者简介：王成博, 硕士研究生, E-mail:cbwang95@作者简介：王婷, 讲师, 博士, E-mail:tingwang@收稿日期：2017-09-04基金：国家自然科学基金 (81602537, 81373119) Construction of a stable 4.1R gene knockout cell model in RAW264.7 cells using CRISPR/Cas9 techniqueWANG Chengbo KANG Qiaozhen DING Cong LI Yawen LIANG Taotao ZHANG Chenglong WANG Wen WANG Ting School of Life Sciences, Zhengzhou University; Abstract： Objective To construct a cell model of 4.1R gene knockout in murine macrophage cell line RAW264.7 using CRISPR/Cas9 technique.Methods Three high-grade small-guide RNAs (sgRNAs) that could specifically identify 4.1R gene were synthesized and inserted into lenti CRISPRv2 plasmid.RAW264.7 cells were infected with sgRNA-Cas9 lentivirus from 293 T cells transfected with the recombinant sgRNA-lenti CRISPRv2 plasmid, and the positive cells were screened using puromycin and the monoclonal cells were obtained.The expression of 4.1R protein in the monoclonal cells was measured by Western blotting, and the mutation site was confirmed by sequence analysis.Result A 4.1R gene knockout RAW264.7 cell line was obtained, which showed a 19-bp deletion mutation in the 4.1R gene sequence and obviously enhanced proliferation.Conclusion We successfully constructed a 4.1R gene knockout macrophage cell line using CRISPR/Cas9 technique, which may facilitate further investigation of the function of 4.1R in macrophages.Keyword： CRISPR/Cas9; 4.1R; gene knockout; RAW264.7 cells; macrophages; Received： 2017-09-04蛋白 4.1R 是一类高度保守的细胞膜骨架蛋白, 属于蛋白 4.1 家族, 此家族还包括 4.1B、4.1N 和 4.1G[1-4]。

研究发现, 蛋白 4.1R 在 T 细胞、B 细胞、巨噬细胞等免疫细胞中高表达[5], CD4T 细胞中, 蛋白 4.1R 通过结合 T 细胞活化连接蛋白 (LAT) 并抑制 ZAP-70 对 LAT 的磷酸化负调控 CD4T 细胞增殖及分化[6];并且, 蛋白 4.1R 通过抑制 CD4T 细胞的活化从而减弱小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎 (EAE) 的病症[7]随着研究的深入, 4.1R 在获得性免疫中的调节作用逐渐被发现, 但 4.1R 在天然免疫尤其是在巨噬细胞中的功能尚不明确对于其功能的研究, 过去传统上依赖于 RNA 干扰技术[8], 但 RNA 干扰技术存在的瞬时性和不彻底性的弊端会影响对基因功能的正确判断[9]而近几年迅速发展起来的CRISPR/Cas9 基因编辑技术能够在基因组水平上特异性剪切目的基因[10], 是研究基因功能的有力的工具本研究拟利用 CRISPR/Cas9 技术定点敲除巨噬细胞系 RAW264.7 细胞中 4.1R 基因, 得到稳定敲除 4.1R 基因的 RAW264.7 细胞株, 为深入研究 4.1R 在巨噬细胞中的作用机制提供有效工具1 材料和方法1.1 材料与试剂鼠源巨噬细胞系 RAW264.7 细胞、293T 细胞、lenti CRISPRv2 质粒 (实验室保存) ;PEG6000 慢病毒纯化试剂、慢病毒包装辅助载体 p H1、p H2 质粒 (英茂盛业生物科技) ;质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、细胞基因组 DNA 提取试剂盒 (Axygen) ;DH5α 感受态细胞 (鼎国昌盛生物技术) ;T4 多聚核酸激酶、限制性内切酶 Bsm BI、T4 连接酶 (Ta Ka Ra) ;DMEM 高糖培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素 (Hyclone) ;jet PRIME 转染试剂 (Polyplus Transfection) ;Polybrene (聚凝胺, 翊圣生物科技) ;RIPA 裂解液 (索莱宝) 4.1R 抗体 (Proteintech) ;GADPH 抗体 (Abways) 、辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联山羊抗兔 Ig G (鼎国昌盛生物技术) ;ECL 化学发光液 (Thermo Scientific) , 小向导 RNA (sg RNA) 序列合成及质粒测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 方法1.2.1 sg RNA 的设计和寡核苷酸链的合成根据 CRIS-PR/Cas9 靶向原理, 利用 CRISPR 设计工具 (http://crispr.mit.edu/) , 选择 3 条分数较高的针对 4.1R 外显子的 sg RNA序列, 在正义链模板的 5′端添加 CACC, 反义链模板的 5′端添加 AAAC, 与Bsm BⅠ酶切后形成的黏性末端互补同时根据靶位点设计 CRISPR/Cas9 敲除鉴定引物 4.1R-F:5'-AGATTCTGAAACGAAG-3', 4.1R-R:5'-TCTTCTGTTAATTGTGCTG-3'1.2.2 重组真核表达质粒 lenti CRISPRv2-sgRNA 构建使用 Bsm BⅠ限制性内切酶酶切质粒 lenti CRISPRv2 质粒并切胶回收合成的寡核苷酸单链 sg RNA 用 T4 多聚核苷酸激酶对退火形成二聚体, 用 T4 连接酶将退火后的 sg RNA 与胶回收的 lenti CRISPRv2 质粒连接, 然后将连接产物体系转化到 DH5α 感受态细胞中, 涂于氨苄抗性的 LB 培养基平板上, 挑取单菌落并摇菌培养, 小提质粒并测序鉴定。

1.2.3 293T 细胞培养与慢病毒制备将 293T 细胞用 DMEM 培养基常规培养, 转染前以细胞密度生长至 60%~80%将构建好的 sg RNA-lenti CRISPRv2 质粒和慢病毒包装辅助载体 p H1、p H2 质粒按照 sg RNA-lenti CRISPR∶p H1∶p H2 为 9∶3∶1 的比例混合, 将混合好的慢病毒表达系统按照 jet PRIME 转染试剂说明书转入 293T 细胞内, 转染 48 h后收集细胞上清, 按照 PEG6000 慢病毒纯化试剂说明书纯化慢病毒1.2.4 RAW264.7 细胞培养与慢病毒侵染RAW264.7 细胞 DMEM 培养基常规培养, 侵染前将细胞接种至 12 孔板, 当细胞密度生长为 80%左右, 每孔加入 sg RNA-Cas9 慢病毒 50~200μL、Polybrene (聚凝胺) 6μg/m L, 加入 DMEM 培养基补足至 1 m L, 侵染 24 h 后改换为 DMEM 培养基继续培养1.2.5 敲除 4.1R 基因的 RAW264.7 细胞株的单克隆筛选sg RNA-Cas9 慢病毒侵染 RAW264.7 细胞 48 h 后, 更换含 2.5μg/m L 嘌呤霉素的 DMEM 培养基, 1 周后, 将带有抗性的细胞采用有限稀释法接种至 96 孔板, 待细胞形成单克隆集落后, 用枪头吸取吹散于 24 孔板内, 长满后接种至 6 孔板培养。

1.2.6 敲除 4.1R 基因的 RAW264.7 细胞株的鉴定6 孔板内长满的细胞, 部分细胞保种, 余下细胞继续培养长满 6 孔板时加入RIPA 裂解液提取蛋白, 提取蛋白加入 SDS 缓冲液沸水浴 10 min, 进行 SDS-PAGE 电泳电泳, 结束后转移至 PVDF 膜, 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h, 内源性4.1R 抗体 4℃过夜孵育, TBST 洗膜, HRP 偶联的羊抗兔 Ig G 室温孵育 1 h, TBST 洗膜, ECL 化学发光液进行显影、曝光经 Western blotting 印记检测的蛋白 4.1R 完全没有表达的 RAW264.7 细胞提取基因组 DNA, 经 PCR 扩增后将产物交付苏州金唯智公司测序, 测序结果与 4.1R 基因进行比对1.2.7 CCK8 细胞增殖实验将处于对数生长期的细胞以密度为 2×10 细胞/m L, 传至 96 孔板, 每孔100μL, 每组实验设计 5 复孔, 在 37℃, 5%CO 2细胞培养箱中培养 24、48、72 h, 每孔加入 10μLCCK8 试剂, 在孵箱培养 1~4 h, 在 450 nm 处读取吸光度 (A) 。

1.2.8 统计学处理计数数据以均数±标准差表示, 采用 Graph Pad Prism 5.0 软件进行分析, 两组间采用 student's T test 比较, 以 P<0.05 表示差异具有统计学意义2 结果2.1 sg RNA 靶点的选择及寡核苷酸链设计4.1R 基因上有两个起始密码子, 分别编码大。