微生物研究进展chapter23微生物基因组学研究进展.ppt

第二章第二章 微生物基因组学研究进展微生物基因组学研究进展第一节第一节 微生物基因组与生物信息学微生物基因组与生物信息学第二节第二节 微生物基因信息的分析微生物基因信息的分析 第三节第三节 芯片技术在微生物学领域的应用芯片技术在微生物学领域的应用农农学学系生物技系生物技术专业课术专业课程程《《微生物微生物学研学研究究进进展展》》第二节第二节 微生物基因信息的分析微生物基因信息的分析 一、微生物基因组信息的获得一、微生物基因组信息的获得二、二、 基因组序列诠释基因组序列诠释一、微生物基因组信息的获得一、微生物基因组信息的获得1、基因组测序及数据处理、基因组测序及数据处理n⑴ DNA测序的一般方法n⑵ 序列的组装 2、从网络数据库获得基因组信息、从网络数据库获得基因组信息⑴ DNA测序的一般方法n链终止法测序n化学降解法测序n自动化测序n非常规DNA测序①① 链终止法测序链终止法测序 (the chain termination method) 基本原理基本原理: 通过合成与单链通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待分子，从而来读取待测测DNA分子的顺序。

分子的顺序技术路线与要求技术路线与要求制备单链模板制备单链模板 ↓将将单链模板与一小段引物退火模板与一小段引物退火 ↓加入加入DNA多聚多聚酶 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸分分别加入少量加入少量4种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸 ↓将将4种反种反应产物分物分别在在4条泳道条泳道电泳泳 ↓根据根据4个碱基在个碱基在4条泳道的条泳道的终止位置止位置读出基因序列出基因序列 A 克隆于质粒中克隆于质粒中DNA→→用碱或热变性用碱或热变性B M13B M13克隆单链克隆单链DNADNAC C 噬粒克隆噬粒克隆DNADNAD PCRD PCR产生单链产生单链DNADNAA 高酶活性高酶活性B 无无5’→3→3´ ´外切酶活性外切酶活性C C 无无3 3´ ´→5→5´ ´外切酶活性外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的的3’碳原子碳原子连接的是氢原子连接的是氢原子,不是不是羟基羟基②② 化学降解法测序化学降解法测序n基本原理基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学集团在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化再用化合物处理合物处理,使使DNA分子在被修饰的位置降解分子在被修饰的位置降解.技术路线技术路线 将双将双将双将双链链链链DNADNA样品变为单链样品变为单链样品变为单链样品变为单链 ↓ ↓ 每个每个每个每个单链单链的同一方向末端都用放射性同位素的同一方向末端都用放射性同位素的同一方向末端都用放射性同位素的同一方向末端都用放射性同位素标记标记, ,以便以便以便以便显显示示示示DNADNA条条条条带带 ↓ ↓ 分分分分别别用不同方法用不同方法用不同方法用不同方法处处理理理理, ,获获得只差一个核苷酸的得只差一个核苷酸的得只差一个核苷酸的得只差一个核苷酸的降降降降解解解解DNADNA群体群体群体群体 ↓ ↓ 电电泳泳泳泳, ,读读取取取取DNADNA的核苷酸的核苷酸的核苷酸的核苷酸顺顺序序序序③ ③ 自动化测序自动化测序n基本原理基本原理 与链终止法测序原理相同与链终止法测序原理相同,只是用不同只是用不同的的荧光色彩荧光色彩标记标记ddNTP,如如ddATP标记标记红色红色荧光荧光,ddCTP标记标记蓝色蓝色荧光荧光, ddGTP标记标记黄色黄色荧光荧光, ddTTP标记标记绿色绿色荧光荧光.由于每种由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜带有各自特定的荧光颜色色,而简化为由而简化为由1个泳道同时判读个泳道同时判读4种碱种碱基基.④④ 非常规测序非常规测序n 毛细管电泳毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间节省时间,加快加快测序进程测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法其他程序同链终止法或化学测序法.n 光点测序光点测序 脱氧三磷酸核苷酸脱氧三磷酸核苷酸连接到连接到DNA 3’-末端末端时会释放时会释放1个焦磷个焦磷酸酸(PPi) ,焦磷酸焦磷酸在在磷酸化酶磷酸化酶的作用下转化为化学能的作用下转化为化学能,并发出并发出光亮光亮.由此由此,往反应液中每次只加入往反应液中每次只加入1种核苷酸种核苷酸,当加入的核苷当加入的核苷酸结合时酸结合时,反应液发出亮点反应液发出亮点,并记录核苷酸种类并记录核苷酸种类;当核苷酸未当核苷酸未结合时结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定由此来测定DNA序列序列. DNA测序胶图支持毛细管阵列电泳、DNA芯片等的测序技术的发展；nDNADNA芯片测序芯片测序 基本原理基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的待检测的DNA分子与芯片温浴分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装序进行对比组装,拼接成完全的拼接成完全的DNA顺序顺序.利用基因芯片进行杂交测序的原理利用基因芯片进行杂交测序的原理⑵ ⑵ 序列的组装序列的组装①① 随机测序与序列组装随机测序与序列组装 随机测序也称随机测序也称”鸟枪法鸟枪法”. 序列组装原理序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点优点:不需预先了解任何基因组的情况不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装ABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装鸟枪法鸟枪法(Shotgun)测序的问题测序的问题 CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP错装错装Shotgun法序列拼接法序列拼接Sequence GapSequence Gap 实例实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装顺序组装超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组DNA ↓琼脂糖脂糖电泳收集泳收集1.6∼ ∼2.0Kb的区段、纯化的区段、纯化 ↓构建到质粒载体中构建到质粒载体中 ↓随机挑选随机挑选19687个克隆个克隆,进行进行28643次测序次测序,得到可读顺序得到可读顺序为为11 631 485 bp ↓组装成组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, ↓ 各重叠群间仍有间隙各重叠群间仍有间隙各重叠群间仍有间隙各重叠群间仍有间隙 顺序间隙顺序间隙顺序间隙顺序间隙 物理间隙物理间隙物理间隙物理间隙 ↓ ↓↓ ↓ 载体或宿主菌载体或宿主菌载体或宿主菌载体或宿主菌 选用不当而被丢失选用不当而被丢失选用不当而被丢失选用不当而被丢失的顺序的顺序的顺序的顺序测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序解决办法解决办法:通过相邻已知通过相邻已知顺序作为探针筛选已有顺序作为探针筛选已有的基因组文库的基因组文库解决办法解决办法:利用其它宿主菌利用其它宿主菌与载体重新构建文库与载体重新构建文库②② 限制测序限制测序n n 限制测序：是指将一段染色体区段的限制测序：是指将一段染色体区段的DNA DNA 顺顺序进行组装序进行组装. . 一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法因组测序中也采用这一方法. . 如高等植物如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据完全依据克隆重叠群克隆重叠群, ,先进行各个先进行各个BACBAC克隆的随机测序克隆的随机测序, ,再进行序列组装；再进行序列组装； 水稻基因组测序计划采取得策略与此相同计划采取得策略与此相同. .2000年年6月公共领域测序计划工作框架图月公共领域测序计划工作框架图③③ 指导测序与序列组装指导测序与序列组装建立在基因组图谱基础上的建立在基因组图谱基础上的建立在基因组图谱基础上的建立在基因组图谱基础上的” ”鸟枪法鸟枪法鸟枪法鸟枪法” ”, , 即所即所即所即所谓谓谓谓” ”指导鸟枪法指导鸟枪法指导鸟枪法指导鸟枪法” ”或或或或” ”指导测序指导测序指导测序指导测序” ”。

 先将染色体打成比较大的片段先将染色体打成比较大的片段(几十几十-几百几百Kb), 利用利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分分别测序后拼装别测序后拼装. 这种策略叫这种策略叫基于克隆群基于克隆群(contig-based)的策略的策略.ABCABC大片段大片段contig小片段测序拼装小片段测序拼装两种策略的比较两种策略的比较鸟枪法策略鸟枪法策略 指导测序指导测序策略策略不需背景信息不需背景信息 构建克隆群构建克隆群 (遗传、物理图谱遗传、物理图谱)时间短时间短 需要几年的时间需要几年的时间 需要大型计算机需要大型计算机得到的是草图得到的是草图(Draft) 得到精细图谱得到精细图谱④④ 其他测序路线其他测序路线n重要区域优先测序重要区域优先测序 人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序优先测序.如如:人类主要组织相容性复合区位于第人类主要组织相容性复合区位于第6号染色号染色体体,与人类免疫系统有关，因而优先测序与人类免疫系统有关，因而优先测序.n nEST (Expressed sequence tag) EST (Expressed sequence tag) 测序测序测序测序 ESTEST是一种重要的基因组图分子标记是一种重要的基因组图分子标记是一种重要的基因组图分子标记是一种重要的基因组图分子标记, ,以以以以ESTEST为探为探为探为探针很容易从针很容易从针很容易从针很容易从 cDNAcDNA文库中筛选全基因文库中筛选全基因文库中筛选全基因文库中筛选全基因, ,又可从又可从又可从又可从BACBAC克克克克隆中找到其基因组的基因序列隆中找到其基因组的基因序列隆中找到其基因组的基因序列隆中找到其基因组的基因序列. . 优点优点优点优点: : A mRNA A mRNA 可直接反转录成可直接反转录成可直接反转录成可直接反转录成cDNAcDNA, ,而且而且而且而且cDNAcDNA文库也文库也文库也文库也比较容易构建比较容易构建比较容易构建比较容易构建; ; B B 对对对对cDNAcDNA文库大量测序文库大量测序文库大量测序文库大量测序, ,即可获得大量即可获得大量即可获得大量即可获得大量ESTEST的序列的序列的序列的序列; ; C EST C EST为基因的编码区为基因的编码区为基因的编码区为基因的编码区, ,不包括内含子和基因间区域不包括内含子和基因间区域不包括内含子和基因间区域不包括内含子和基因间区域, ,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因一次测序的结果足以鉴定所代表的基因一次测序的结果足以鉴定所代表的基因一次测序的结果足以鉴定所代表的基因; ;⑵ 序列的组装 大规模测序的每一个环节都与数据分析紧密相关大规模测序的每一个环节都与数据分析紧密相关 过程复杂、工作量大过程复杂、工作量大 有效的数据分析算法与软件有效的数据分析算法与软件 大规模测序中的数据分析大规模测序中的数据分析大规模测序中的数据分析大规模测序中的数据分析大规模测序及大规模测序及数据分析过程数据分析过程 LocusLink 基因和蛋白质信息的概括性资源基因和蛋白质信息的概括性资源【【NCBI】】 RefSeq 最稳定、最被承认的基因和蛋白质的序列最稳定、最被承认的基因和蛋白质的序列【【NCBI】】 UniGene 给出基因序列、以及图谱信息、同源基因、表达信给出基因序列、以及图谱信息、同源基因、表达信息息【【NCBI】】 Entrez 用于提取序列信息，很好的查询、提取和显示系统用于提取序列信息，很好的查询、提取和显示系统【【NCBI】】 Ensemble 与与Entrez同样功能的系统同样功能的系统【【EBI】】 ExPASy 用于获取蛋白质及其相关数据用于获取蛋白质及其相关数据【【 SIB】】（（Swiss Institute of Bioinformatics ）） Every road leads to Rome!2、从网络数据库获得基因组信息、从网络数据库获得基因组信息例子：例子：E. coli K-12基因组基因组 以使用以使用Entrez进行查询为例进行查询为例查询查询Escherichia coli K12基因组的信息：基因组的信息：DNA polymerase II二、二、 基因组序列诠释基因组序列诠释第二节第二节 微生物基因信息的分析微生物基因信息的分析 1. 寻找基因寻找基因2. 获取基因全长获取基因全长cDNA序列序列3. 实验确认基因功能实验确认基因功能4. 微生物基因组信息的分析微生物基因组信息的分析• 是遗传信息的物理和功能单位，包含是遗传信息的物理和功能单位，包含产生一条产生一条多肽链或功能多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。

所必需的全部核苷酸序列 Ø 基因分类：基因分类： 编码编码RNA的基因，如的基因，如rRNA基因，基因，snRNA基因基因等；编码蛋白质的基因等；编码蛋白质的基因基基 因因基因的不连续性基因的不连续性Intron 和和Exon: 大多数真核生物蛋大多数真核生物蛋白质基因的编码顺白质基因的编码顺序序(Exon)都被或长都被或长或短的非编码顺序或短的非编码顺序(Intron)隔开隔开重叠基因重叠基因:同一段同一段DNA 能携带两种不同蛋白的信息能携带两种不同蛋白的信息.重迭基因有以下几种情况：重迭基因有以下几种情况：*一个基因完全在另一个基因内部一个基因完全在另一个基因内部*部分重叠部分重叠* 两个基因共用少数碱基对两个基因共用少数碱基对 *一个基因完全在另一个一个基因完全在另一个基因内部基因内部如：如：B和和A，， E和和D 其读码结构互不相同其读码结构互不相同 ---ATG-----//------AATGCC ----//---ATAACG---//--TAA----A*BATGCCN----NNATAA*部分重叠部分重叠 如：如： K和和C *两个基因共用少数两个基因共用少数碱基对碱基对 如：如： D和和J-------TAATG-------D 终止密码子终止密码子J 起始密码子起始密码子问题问题n n基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？n n基因组作为一个整体如何行使其功能？基因组作为一个整体如何行使其功能？n n用什么方法寻找基因，研究基因的功能？用什么方法寻找基因，研究基因的功能？主要内容：主要内容：n寻找基因寻找基因n获取基因的全长获取基因的全长cDNA序列序列n确定确定DNA顺序中基因的位置顺序中基因的位置n研究基因的功能研究基因的功能n基因表达基因表达n蛋白质组学蛋白质组学1. 寻找基因寻找基因⑴⑴ 根据开放读码框预测基因根据开放读码框预测基因①① 起始密码子起始密码子 ATGn第一个第一个ATG的确定则依据的确定则依据Kozak规则规则; Kozak规则是基于已知数据的统计结果，所谓规则是基于已知数据的统计结果，所谓Kozak规则，即规则，即第一个第一个ATG侧翼序列的碱基分布侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。

所满足的统计规律若将第一个若将第一个ATG中的碱中的碱基基A，，T，，G分别标为分别标为1,2，，3位，则位，则Kozak规则规则可描述如下：可描述如下：Ⅰ Ⅰ 第第第第4 4位的偏好碱基为位的偏好碱基为位的偏好碱基为位的偏好碱基为GG；；；；ⅡⅡ ATG ATG的的的的5 5’’’’端约端约端约端约15bp15bp范围的侧翼序列内不含碱基范围的侧翼序列内不含碱基范围的侧翼序列内不含碱基范围的侧翼序列内不含碱基T T；；；；ⅢⅢ 在在在在-3-3，，，，-6-6和和和和-9-9位置位置位置位置，，，，GG是偏好碱基；是偏好碱基；是偏好碱基；是偏好碱基；ⅣⅣ 除除除除-3-3，，，，-6-6和和和和-9-9位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，C C是偏好碱基是偏好碱基是偏好碱基是偏好碱基n n信号肽分析信号肽分析信号肽分析信号肽分析 信号肽分析软件信号肽分析软件信号肽分析软件信号肽分析软件( (SignalPSignalP http://http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalPwww.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ /) ) 把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整mRNA 5mRNA 5’’’’端的端的端的端的ContigContig翻译为蛋翻译为蛋翻译为蛋翻译为蛋白序列白序列白序列白序列; ; 然后用然后用然后用然后用SignalPSignalP软件对前软件对前软件对前软件对前5050个氨基酸序列个氨基酸序列个氨基酸序列个氨基酸序列( (从第一个从第一个从第一个从第一个ATGATG对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸MetMet开始开始开始开始) )进行评估，如果进行评估，如果进行评估，如果进行评估，如果SignalPSignalP分析给出分析给出分析给出分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽正面结果，则测试序列有可能为信号肽正面结果，则测试序列有可能为信号肽正面结果，则测试序列有可能为信号肽; ; 假如在该测试序列的第一个假如在该测试序列的第一个假如在该测试序列的第一个假如在该测试序列的第一个Met 5Met 5’’’’端存在端存在端存在端存在终止密码子终止密码子终止密码子终止密码子，，，，该序列为信号肽的可能性更大。

该序列为信号肽的可能性更大该序列为信号肽的可能性更大该序列为信号肽的可能性更大② 终止密码子 终止密码子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% GC% = 50% 终止密码子每终止密码子每 64 64 bpbp出现一次；出现一次；GC% > 50% GC% > 50% 终止密码子每终止密码子每100100－－200 200 bpbp 出现一次出现一次③ 3’端的确认 3’’端的确认主要根据端的确认主要根据Poly(A)尾序列，若尾序列，若测试测试Contig不含不含Poly(A)序列，则根据加尾信序列，则根据加尾信号序列号序列“AATAAA””和和BLAST同源性比较结同源性比较结果共同判断果共同判断④④ 非编码序列、内含子非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度不少于高等真核生物多数外显子长度不少于100 个密码子，有的不到个密码子，有的不到50个密码子甚至个密码子甚至更少⑤⑤ 密码子偏爱性密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。

位碱基不同 不同种属间使用同义密码的频率有很大差不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（异，如人类基因中，丙氨酸（Ale））密码子多密码子多为为GCA,GCC或或GCT,而而GCG很少使用很少使用⑥⑥ 外显子－内含子边界外显子－内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如：外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如：n 内含子的内含子的5‘端或称供体位（端或称供体位（donor site））常常见的顺序为见的顺序为 5’－－AG↓GTTAAGT-3’；；n 3’端又称受体位（端又称受体位（acceptor site), 多为多为5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，嘧啶核苷酸，T或或C)；；⑦⑦ 上游控制顺序上游控制顺序 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表结合蛋白作用，控制基因表达 另外个别生物的基因组特有组成也可作为判另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。

岛 ⑧⑧ 软件预测软件预测 采用采用NCBI的的ORF预测软件预测软件 ( ORF finder: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi )判断判断ORF的可能范围的可能范围⑵⑵ mRNA的的5’’端即转录起始位点区端即转录起始位点区 通过同源性比较来预测通过同源性比较来预测mRNA的的5’’端，端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/ )⑶⑶ 同源查询途径同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询界定基因的方法称为同源查询 同源有如下几种情况： A DNA序列某些片段完全相同；B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子；C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；D 模拟多肽高级结构相似⑷⑷ 试验分析试验分析Northern 杂交确定杂交确定DNA片段是表达序列：片段是表达序列： 注意事项：注意事项： a 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；会出现多个信息； b 考虑组织专一性和发育阶段的问题。

考虑组织专一性和发育阶段的问题 C 基因表达产物丰度的问题 如果风度较低，用拟Northern 杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析 拟Northern 杂交—— 根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交n动物园杂交动物园杂交—— 根据亲缘关系相似的物种，根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理如果某一物种的的同源性很低的原理如果某一物种的DNA 顺序与来自另一亲缘物种的顺序与来自另一亲缘物种的DNA片段片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有杂交产生阳性信号，该区段可能含有1个或个或多个基因，这种方法又称为动物园杂交多个基因，这种方法又称为动物园杂交2. 获取基因全长获取基因全长cDNA序列序列A 构建cDNA文库，用目的基因DNA片段筛选文库B 根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因的全长cDNA序列 cDNA文库构建cDNA文库构建5’RACE3’RACE3. 实验确认基因功能实验确认基因功能⑴⑴ 基因敲除基因敲除(knock-out)n 最简便的基因失活的方法最简便的基因失活的方法.n 主要原理主要原理:n 在一段无关在一段无关DNA 片段的两侧连接与替换基片段的两侧连接与替换基因因两侧两侧相同的顺序，将这一构建导入目的细胞，相同的顺序，将这一构建导入目的细胞，由于由于同源片段之间的重组同源片段之间的重组，可使无关片段取代靶，可使无关片段取代靶基因，整合到染色体中。

为了便于筛选，用于取基因，整合到染色体中为了便于筛选，用于取代的外源代的外源DNA中中含有报告基因含有报告基因 ⑵⑵ 基因超时表达基因超时表达 通过增加通过增加基因的拷贝数和采用强启动子基因的拷贝数和采用强启动子促使基促使基因超表达，致使受体表现出生长与发育的异常，来因超表达，致使受体表现出生长与发育的异常，来研究基因的功能研究基因的功能⑶ 基因转导技术 导入细胞，观察功能 该方法用的最多，技术最成熟⑴ ⑴ 比较基因组学比较基因组学(Comparative Genomics)(Comparative Genomics) 概念：是基于基因组图谱和测序基础上，对已概念：是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科的功能、表达机理和物种进化的学科4. 微生物基因组信息的分析微生物基因组信息的分析⑵ ⑵ 功能基因组学研究功能基因组学研究 利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能。

统地分析全部基因的功能。