发酵9项目九透明质酸的生产.ppt

项目九项目九 透明质酸的生产透明质酸的生产化妆品级透明质酸化妆品级透明质酸 透明质酸是高档化妆品不可缺少的天然保湿成分，可以广泛用于保湿、抗衰老、防晒、创伤护理、亮发素、洗发护发香波及浴液等产品中，添加量一般为0.05%～0.5% 食品级透明质酸食品级透明质酸 目前，透明质酸在美国、日本等发达国家被广泛用于美容保健食品中，深受消费者认可 20世纪八十年代末，口服透明质酸美容保健食品出现于日本 单元知识一透明质酸的应用单元知识一透明质酸的应用医药级透明质酸医药级透明质酸 透明质酸可用作眼科人工晶体植入手术的粘弹剂、骨性关节炎和类风湿性关节炎等关节手术的填充剂，作为媒介在滴眼液中广泛应用，还用于预防术后粘连和促进皮肤伤口的愈合透明质酸与其它药物反应形成的化合物对药物发挥缓释作用，可达到定向和定时释放的目的随着医药科技的发展，透明质酸在医药方面的应用将越来越广泛 透明质酸是减缓关节炎疼痛的良药 单元知识一单元知识一 透明质酸的应用透明质酸的应用 透明质酸在体内的生理功能已不局限于网状结构及黏弹性等物理机械功能。

透明质酸受体的发现对透明质酸的认识有了质的飞跃，揭示了其通过受体的结合，调节细胞的功能从而在胚胎发育，肿瘤发生，组织愈合等方面扮演了重要角色透明质酸受体的发现还有助于开发新的给药途径明确掌握透明质酸代谢机制，通过发现其代谢异常，可对一些疾病的诊断和治疗具有指导意义透明质酸应用的展望透明质酸应用的展望项目动物组织提取法发酵法存在状态在原料中与蛋白质和其他粘多糖形成复合体，分离纯化复杂在发酵液中游离存在，易于分离纯化相对分子质量取决与动物组织原料，基本无法控制，一般为（0.1-2.5）*106可通过发酵培养参数条件进行控制，一般为（1.0-4.0）*106品质与产量取决于动物组织原料的品质与数量品质可控，产量无限制成本高低发酵法生产透明质酸的优点发酵法生产透明质酸的优点利用天然原料即从动物组织中提取利用天然原料即从动物组织中提取 主要原料是人的脐带、鸡冠和牛眼玻璃体等用丙酮或乙醇将原料脱脂、脱水、风干后，用蒸馏水浸泡、过滤，然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理，之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液，最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸，该法提取率极低，仅为1％左右 透明质酸的制备方法透明质酸的制备方法生物发酵法生物发酵法 以葡萄糖作为碳源，在培养基中发酵48h，发酵结束后，过滤除去菌体和杂质，然后用醇沉淀法等简单操作即得到高纯度的透明质酸。

采用发酵法制得的透明质酸，优点是能按商品设计来设定分子量发酵法的关键在于菌种的选择，目前多选用链球菌属类菌种等透明质酸的制备方法透明质酸的制备方法兽疫链球菌兽疫链球菌镜下观察，圆圆的，常见多个细菌连在一起，成链状，故称链球菌以透明质酸为主要成分的荚膜围绕在菌体周围，保护细菌免受伤害链球菌正常生长是一个产酸过程，通常做法在稳定期提高发酵液的pH值结果部分链球菌因pH突然变大而停止生长并产生荚膜，那些继续生长的链球菌会不断产酸，使发酵液pH恢复正常此时再次提高发酵液pH如此往复菌体不但能正常生长而且能不断的产生我们所需要的荚膜但是整个过程中pH值不能调的过高，如果过高，菌体因无法承受而被杀死 单元技能单元技能 透明质酸的发酵生产透明质酸的发酵生产一、菌种和培养基一、菌种和培养基链球菌属于兼性厌氧菌，在透明质酸的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明质酸的两个活化前体物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于透明质酸的合成 培养基培养基p斜面培养基/％：葡萄糖0.2，牛肉膏1.0，蛋白胨2.0，酵母抽提物 0.5，NaCl 0.2，Na2HPO4•12H2O 0.1，KH2PO40.012，琼脂2.0；pH7.0～7.2。

p种子培养基/％：同斜面培养基，不加琼脂p发酵培养基/％：蛋白胨 2 .0，酵母抽提物1.0，MgSO4•7H2O 0.1，K2HPO4 0.25，NaCl 0.2；pH7.0～7.2葡萄糖配成50％的水溶液，单独灭菌生产透明质酸用培养液，氮源为蛋白胨，酪蛋白水解液，酵母膏，牛肉膏，大豆蛋白水解液，尿素，无机铵盐等其中，酵母膏最为常用，除作为氮源外，还含有多种维生素和生长因子，有些是链球菌生长所必需的在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可提高透明质酸的产率碳源主要是各种单糖，蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖，要求药品级口服葡萄糖，其他还有磷酸盐，硫酸盐等无机盐纯化水不含金属离子，溶解物料氢氧化钠：为中和剂，因为发酵时产酸，导致PH降低，从而减缓反应速率斜面种子→摇瓶种子→接种→发酵培养→补料→放罐→发酵液（加乙醇粗提）→粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH→过滤（去除杂质）→滤液（乙醇沉淀）→沉淀物（脱水干燥）→成品透明质酸二、工艺流程二、工艺流程 三、种子扩大培养三、种子扩大培养摇瓶培养摇瓶培养 取斜面种子，接种于装有灭菌培养液的三角瓶中，37℃培养12h～16h，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染即可接种到种子罐中。

培养液的配方：蛋白胨10g ，牛肉膏5g ，酵母膏5g ，葡萄糖5g ，磷酸氢二钾2g ，硫酸锰0.3g ，加水溶解至1L ，115℃灭菌30min500L500L种子罐接种操作种子罐接种操作 1、调种子罐压0.05Mpa；调大接种口排污阀门，调小接种口靠罐阀门，使排气口有气排出即可，关闭接种口排污阀门；2、点燃火焰圈，放于接种口下方5cm处；3、在火焰保护下，迅速解开接种口外套，解开软管上包扎用棉绳，迅速将软管套上接种口；4、移走火焰圈，用卡箍将软管套牢；5、打开接种口靠罐阀门；6、逐渐升高罐内压力至0.08Mpa，稳定后缓慢降低罐压（压力不能低于0.03Mpa），将种子液接入罐内；7、如一次不能接完，可重复⑥中的升压和降压，直至种子液全部接入罐内；8、关闭接种口靠罐阀；9、打开接种口排污阀门，卸清种子瓶内的压力，取下接种瓶，关闭接种口排污阀，旋上接种口外套；10、调节种子罐培养参数，开始培养种子罐培养（种子罐培养（500L500L种子罐）种子罐） 通过压差法或火焰接种法将摇瓶种子接种到种子罐中，温度37～37.5℃；罐压：0.05Mpa；通气量5.6m3/h；搅拌转速60rpm；通气量50L/min，培养过程中pH用20%的NaOH调节，维持6.8～7.0。

培养时间12h~16h 自接种起，按规定时间取样具体为0h、5h、9h、10h、11h取样时间根据菌体生长情况作一定调整检查项目为还原糖、pH、镜检光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中取取 样样无杂菌、菌体数量较多、残糖含量1.5～2.0g/L；周期约12h在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在37℃，或在不同的阶段采用不同的温度在种子培养阶段和发酵初期，37℃培养可使菌体较快地生产增殖，发酵中期和后期可适当地降低温度，这样做可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成透明质酸，提高透明质酸的产率和相对分子质量移种标准移种标准 等到种子罐内的种龄达到工艺要求，进行以下操作：1、关闭种子罐的出气阀门，使罐内的压力逐渐上升到0.10～0.12 Mpa之间；2、关闭种子罐的取样排污阀和发酵罐的移种管道排污阀；3、将与移种相关的阀门打开，并关闭或切断与之无关的阀门；4、迅速同时打开发酵罐和种子罐的移种阀，将种子罐内合格的菌种移入发酵罐内达到工艺要求的菌种量；5、关闭发酵罐的移种阀四、四、5T5T发酵罐移种操作发酵罐移种操作 1 1、培养条件、培养条件温度：接种后36.8～37.0℃；10h后37.1～37.3℃；17h后37.5～37.8℃罐压：0.05Mpa通气量：接种后72m3/h；补料1h后90m3/h转速：接种后50rpm/min；补料1h后80rpm/minpH：培养过程中前期控制在6.9～7.0；补料后1h控制在6.9～8.0五、发酵培养（五、发酵培养（5 5吨）吨） 综合pH及糖代谢情况决定是否放罐。

当1min内pH下降低于0.02以下，糖浓度降低至3～5g/L（或糖不消耗，不加碱）时即可放罐发酵周期作为参考依据六、放罐六、放罐 发酵结束后，进入提取阶段将发酵液移至干净的粗提罐内，加入95%的乙醇进行粗提之后将粗提液移至一干净的罐内，加入纯水溶解，在搅拌下加入助滤剂以及活性炭，分别用NaOH和HCl进行大幅度地调整pH使蛋白质失活变性然后过滤去除菌体、杂蛋白、重金属等杂质滤液用95%的乙醇沉淀，沉淀物再用乙醇脱水，然后干燥得成品透明质酸注：干燥的温度在50℃～60℃，温度过高会影响透明质酸的生物活性，反之又会延长干燥的时间而浪费能源）七、分离纯化七、分离纯化。