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第七章 分子标记技术什么是遗传标记？什么是遗传标记？u遗传标记遗传标记 genetic marker:指可追踪染色体、 染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任 何一种遗传特性u它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性 ；u因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可 作为遗传标记遗传标记的类型遗传标记的类型ü 形态学标记（morphological marker）ü 细胞学标记(cytological marker)ü 生化标记(biochemical marker)Ø 分子标记(molecular marker)：DNA分子遗 传标记，或DNA标记形态学标记形态学标记l形态标记即个体的外部形态特征l形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多 数有限、多态性较差，表现易受环境影响，并且 有一些标记与不良性状连锁此外形态标记的获 得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长 l主要在早期使用细胞遗传标记细胞遗传标记l细胞学标记即植物细胞染色体的变异l包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、 着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化 l与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些 重要基因的染色体或染色体区域定位。

l细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来 培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏 感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测生化标记生化标记l生化标记包括同工酶和等位酶标记以酶作为标记 ）同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位 的不同等位基因编码的酶的不同分子形式分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的 多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型l生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对生物经济性状一 般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小l生化标记的应用有限：一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技 术有一定难度材料的采集研磨和酶的提取酶的保存凝胶制备电泳凝胶切片酶的组织化学染色酶谱的记录与分析数据分析同工酶与等位酶分析的过程同工酶与等位酶☛ 酶谱照片n在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种 和个体发育、组织分化等n例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链， 进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链n又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测 物种的地理来源、分类等n动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。

法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系n细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同工酶谱的比 较来确定n在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发 育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程 分子标记分子标记分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差 异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异 分子标记的优越性表现为： （1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检 测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体分子标记的三个阶段分子标记的三个阶段随着分子生物学技术发展和研究水平的深入，分 子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代DNA分 子标记Ø 第一代分子标记：RFLP;RAPD;AFLP； mtDNA分子标记Ø 第二代分子标记：微卫星（ms）(微卫星DNA)； ISSRØ 第三代分子标记：SNP(单核苷酸多态性)；EST目前的分子标记类型目前的分子标记类型目前的分子标记有三类： ü 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括 RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等；ü 第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、 简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段长度多态性标记AFLP、序标位 STS、序列特征化扩增区域SCAR等；ü 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标 签EST标记等。

1 1、、RFLPRFLP基本原理：特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶切后，产生分子量 不同的同源等位片段，再通过电泳的方法分离和检测这些片段限制性内切酶识别DNA中特殊的核苷酸序列不同个 体中的 酶切位 点不同 ，所以 ，种群 具有限 制性片 段多态 性用特异性的 限制性内切酶 进行酶切， 得到不同长度 的DNA片段， 这些片段在 跑电泳中 会分离限制性片段长度多态性通常被人们用来标记目的基因特点：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受 发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果 稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中 2 2、、RAPDRAPD基本原理：用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地 扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段RAPD标记的特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序 列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技 术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引 物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。

n RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片段n一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性就单一引物而言， 其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱RAPDTemplate DNAPrimers point away from each other, so amplification won’t happenRAPDTemplate DNAPrimers point in the same direction, so amplification won’t happenRAPDTemplate DNAPrimers too far apart, so amplification won’t happen> 2,000 basesTemplate DNAPrimers are just the right distance apart, so fragment is amplified100 - 1,500 basesRAPDMM2 3 4 5 6 7 8 9 10Separated RAPD Fragments4mM MgCl2 1.2 U Taq 5 pM OPA-164mM MgCl2 0.6 U Taq 10 pM OPA-162mM MgCl2 1.2 U Taq 10 pM OPA-16Normal concentrations are shown in yellow text. M = A size standardLowering Magnesium ion concentration results in loss of the largest fragment visible in lanes 2-7RAPD reactions were run in groups of 3 using the same template and primer, but varying Magnesium, polymerase and primer concentrationsWhich variable has the greatest impact on fragment patterns?3 3、、AFLPAFLP基本原理：AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物 的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多 态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。

AFLP标记的特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶 及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2） 典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同 时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（ 4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵 ，实验条件要求较高n首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多 大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的 两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）；然后根据接头序列设计引物 ，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在 胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱 基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才 能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限 制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开 来 技术路线（1）首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选 择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是 EcoRI或PstI或SacI) （2）酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与 特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片 段。

（3）DNA片段的预扩增 （4）在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性 扩增 （5）PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性 胶上电泳 （6）多态性比较分析，特异片段回收克隆分析nAFLP结合了RFLP与PCR技术的特点，兼具RFLP 和RAPD两种方法的特长，既继承了RFLP的稳定 性，又具有了PCR反应快速、灵敏的特点，同时 克服了RFLP和RAPD的缺点采用少数几对引物 的多种组合即可获得大量遗传信息，避免了 RAPD分子标记重复性差、假阳性反应过高等不 利因素的影响，同时又无需任何目的基因组DNA 的背景资料即可完成模板DNA多态性检测，摆脱 了RFLP的转膜、克隆、探针制备、分子杂交等 一系列繁重且又有一定难度的工作 n用AFLP分析的多态性是典型的孟德尔式遗传和选择中性它可以用于遗传分析的各个方面：如用于拟南芥属连锁图的构建用于马铃薯的栽培种的鉴定等AFLP也适于鉴定遗传多样性的物种亲缘关系的研究 1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生 的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析 ，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高 ；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4 ）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较 高。

AFLP特点n专利技术，试剂盒价格贵n需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备n基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高缺点应用AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高 等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，。