脾脏淋巴细胞分离方法.doc

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml离心管，4mlEP管，离心机等1配制的percoll工作液：配制15ml100%percoll液(简称工作液)：13.5mlpercoll原液+1.5ml8.5%Nacl溶液混匀备用2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用0.85%Nacl溶液混匀备用70%percoll液(1.090g/ml):2.1ml工作液+0.9ml60%percoll液(1.077g/ml):1.8ml工作液+1.2ml50%percoll液(1.067g/ml):1.5ml工作液+1.5ml40%percoll液(1.050g/ml):1.2ml工作液+1.8ml30%percoll液(1.043g/ml):0.9ml工作液+2.1ml20%percoll液(1.031g/ml):0.6ml工作液+2.4ml找一只15ml离心管，从低至U高(20%percoll液宀70%percoll液)依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离(1) 颈椎脱臼处死小鼠75%酒精浸泡10min(2) 无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks'液中，将脾脏放入2ml离心管中(3) 将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks'液冲洗4) 收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm10min，弃上清5) 加10ml?红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm10min(6) 洗三遍，1500rpm5min，离心去上清(7) 加入2ml0.85%Nacl溶液混悬沉淀8) 用注射器缓慢沿着事先准备好的梯度分离管中，水平离心1800-2000rpm30-40min(9) 收集想要的分层，用1xPBS洗3遍用完全RPMI-1640培养基混悬沉淀，(调成浓度为1X108/ml的细胞悬液)转入培养皿中，置37C,5%CO2下孵育30min后(去除贴壁的细胞)，收获未贴壁细胞注：贴壁为单核细胞(巨噬细胞，树突细胞)不贴壁的悬浮细胞(T/B/NK细胞)附件1:表人不同血细胞的漂浮密度细胞II浚浮密度11细胞漂浮密度红细胞1汹巴细胞1,052-1.077粒细胞IB溯巴细胞1.062-1075嗜酸性1T淵巴细胞嗜中性|汹巴母细胞单核细胞1,050-1.0661自然杀伤细胞1.050-1070血小板1030-106011（一）原理Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。

渗透压很低（＜20mosm/kgH20）,粘度也很小，可形成高达1.3g/ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（200〜1000g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离二）操作方法及注意事项不同浓度（密度）Percoll溶液的制备：先用9份Percoll与1份8.5%NaCI或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85%NaCI或0.15MPBS）稀释到所需浓度Percoll浓度（%）706050403020比重g/不连续密度梯度Percoll层的制备：先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

1. 离心：一般采用离心力为400g,时间20〜25min由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用三）分离纯化细胞举例1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞45%、42.5%和40%五种不同密度的约1.2〜1.5ml,初步从外周血中分离的离心和取样一般富含NK杀伤活性的（LGL）的纯化：按顺序由下向上逐层加50%、47.5%、Percoll,如用10ml试管（或塑料管）分离，每层PercollPBMC细胞1X108悬于1ml培基中，按要求装样、LGL细胞位于42.5%与45%Percoll界面以及上下二层的Percoll液中2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50%和30%Percoll液收取经PHA（或其它抗原、有丝分裂原）刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC（如肾综合征出血热患者）,按要求装样、离心和取样位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80%以上，位于30%Percoll表面是死细胞。

收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究密度方法计算：配70%percoll液：(70mlX1.123g/ml+30mlX1.0046g/ml)/100ml=1.0875g/ml。