葛根上调肝胰岛素抵抗HepG2细胞OB-RIRS2GLUT1和GLUT2蛋白调节糖代谢的研究.docx

    葛根上调肝胰岛素抵抗HepG2细胞OBRIRS2，GLUT1和GLUT2蛋白调节糖代谢的研究    黎宇+罗新新+严奉东+魏漳彬+涂珺[摘要] 研究中藥葛根对人肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗（IR）模型糖代谢的改善作用并初步探讨葛根降糖的分子作用机制该实验采用课题组优化方法，1×10-9 mol·L-1胰岛素加3.75×10-6 mol·L-1地塞米松联合给药HepG2细胞48 h建立稳定的IR模型；CCK-8法检测葛根含药血清对细胞活性的影响；葡萄糖氧化酶法检测多个时间点（12，15，18，21，24，30，36 h） IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量；蒽酮法检测细胞内糖原含量；Western blot法检测胰岛素受体底物2（IRS2）、瘦素受体（Ob-R）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和GLUT2蛋白表达水平研究结果显示葛根含药血清（5%，10%，15%）对IR-HepG2细胞的活力没有明显的影响；5%和10%葛根含药血清在给药18，21，24 h均显著上调IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量（P[关键词] 胰岛素信号通路； 胰岛素受体底物2（IRS2）； 瘦素受体（Ob-R）； 葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）；GLUT2[Abstract] To observe the anti-hyperglycemic effect of Puerariae Lobatae Radix in hepatocyte insulin resistance（IR） models， and investigate its preliminary molecular mechanism. IR-HepG2 cell model was stably established with 1×10-9 mol·L-1 insulin plus 3.75×10-6 mol·L-1 dexamethasone treatment for 48 h according to optimized protocol in our research group. After IR-HepG2 cells were treated with different concentrations（5%，10% and 15%） of Puerariae Lobatae Radix-containing serum， cell viability was detected by CCK-8 assay； the glucose consumptions in IR-HepG2 cells were separately detected at different time points （12， 15， 18， 21， 24， 30， 36 h） by using glucose oxidase method； intracellular glycogen content was detected by anthrone method； and the protein expression levels of leptin receptor （Ob-R）， insulin receptor substrate-2 （IRS2）， glucose transporter 1（GLUT1） and GLUT2 were detected by Western blot assay. The results showed that Puerariae Lobatae Radix-containing serum （5%， 10% and 15%） had no significant effect on IR-HepG2 cell viability； 5% and 10% Puerariae Lobatae Radix-containing serum significantly increased glucose consumption of IR-HepG2 cells （P<0.01） at 18， 21 and 24 h； 15% Puerariae Lobatae Radix-containing serum elevated the glucose consumption of IR-HepG2 cells at 15 h （P<0.05）， and significantly elevated the glucose consumption at 18， 21， 24 and 30 h （P<0.01） in a dose-dependent manner. The optimized time of anti-hyperglycemic effect was defined as 24 h， and further study showed that Puerariae Lobatae Radix-containing serum could increase intracellular glycogen content after 24 h treatment （P<0.01）， and up-regulate IRS2， Ob-R， GLUT1 and GLUT2 protein expression levels. Our results indicated that Puerariae Lobatae Radix-containing serum could achieve the anti-hyperglycemic effect through important PI3K/PDK signaling pathway partially by up-regulating the expression levels of Ob-R and IRS2， GLUT1 and GLUT2 in IR-HepG2 cells， accelerating the glucose transport into hepatocytes and increasing hepatic glycogen synthesis to enhance the anti-hyperglycemic effect of IR-HepG2 cells. [Key words] insulin resistance （IR）； IRS2； Ob-R； GLUT1； GLUT2众多临床实践发现中药在降糖调脂及治疗2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）中注重调节人体的整体机能，作用温和，长期使用具有较强的竞争优势[1]。

在中药临床辨证治疗，葛根为主的系列经方广泛用于糖尿病发生发展的不同阶段采用分子网络药理学方法发现，葛根主要成分葛根素、大豆苷元、染料木苷等均作用于胰岛素信号PI3K，JNK通路，PI3K，JNK通路在胰岛素信号转导途径中起着重要的作用，其异常的表达可能会影响葡萄糖转运和合成、脂质代谢等[2]已有研究发现葛根颗粒剂可明显改善肥胖小鼠的糖脂代谢紊乱[3]葛根煎剂能显著降低糖尿病大鼠空腹血糖、游离脂肪酸、TNF-α的含量来提高胰岛素敏感指数[4]葛根主要药效成分葛根素能改善T2DM患者血糖[5]，葛根素治疗糖尿病的主要作用机制可能与降血糖、抗氧化应激、抑制蛋白质非酶糖基化等相关[6]本课题组研究发现重用葛根的葛根芩连汤配伍干预糖尿病大鼠呈现更好的降糖降脂药效，可有效减轻胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）本课题组已采用血清药理学方法发现葛根含药血清可明显提高IR-3T3-L1脂肪细胞降糖降脂作用，干预多个糖脂代谢相关基因表达来改善脂肪IR的作用[7]本实验采用先期优化胰岛素加地塞米松的稳定体外肝IR細胞模型[8]，研究葛根含药血清对IR-HepG2细胞糖代谢的影响及并初步探讨降糖的相关分子机制，为葛根的方剂配伍和临床精准用药提供理论指导。

1 材料1.1 药物 人肝癌细胞系HepG2细胞购于北京鼎国生物科技有限公司（源于协和细胞库）葛根（批号912014，产地广西，江西汇仁药业有限公司），葛根素质量分数为5.4%，符合2015年版《中国药典》标准1.2 动物 SPF级雄性SD大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号114007001196271.3 试剂 葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司，GOD-POD法，批号361500）；DMEM高糖培养基（Hyclone公司，批号NAE1396）；胰岛素（Sigma分装）；地塞米松（Sigma公司，批号#BCBC92609V）；Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所，批号JH620）；盐酸二甲双胍（中国食品药品检定研究院，批号41DF-4HDKM）；非诺贝特（中国食品药品检定研究院，批号41DF-4HKJM）；GLUT1抗体（美国Millipore公司，批号#2430566）；GLUT2抗体（美国Abcam公司，批号#ab921599）；Ob-R抗体（美国Santa公司，批号L2673）；IRS-2（美国CST公司，批号3089S）；辣根酶标记山羊抗鼠二抗（联科生物公司，批号#5103930）。

1.4 仪器 倒置显微镜（日本Olympus CKX41）；CO2培养箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；全波长酶标仪（Spectra Max Plus384，美国Molecular Devices）；电泳仪、水平和垂直电泳槽、转移槽（美国Bio-Rad公司）；化学发光凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）2 方法2.1 葛根含药血清的制备及含量测定 参考本课题组已发表文献的方法制备[7]，简述如下：称取葛根药材并加入8倍药重的水，浸泡30～60 min；煮沸40 min后，减压旋转蒸发浓缩制备葛根水提液（1 g·mL-1），保存于4 ℃备用SD雄性大鼠60只，体重（280±20） g，随机分为空白血清组（40只），葛根含药血清组（20只）含药血清组按每100 g大鼠体重给药量2.5 mL给予葛根水提液灌胃制备，分装-20 ℃保存UPLC-MS检测葛根成分葛根素和大豆苷元出峰时间及含量2.2 细胞培养 将冻存的HepG2细胞用15%FBS转至细胞培养瓶中，放37 ℃，5%CO2培养箱中待细胞接触性抑制后，用10%FBS的DMEM培养基每3 d按1∶3传代1次，待细胞从复苏适应2周后，于对数生长期进行实验。

2.3 IR-HepG2细胞模型建立 参考本课题先期优化肝IR模型建立方法[8]，用1×10-9mol·L-1胰岛素加3.75×10-6 mol·L-1地塞米松培养诱导48 h后，弃去培养液，PBS洗涤2次，再用培养基37 ℃孵育20 min；重复上述过程1次，换上无血清培养液孵育24 h后，检测各组细胞培养基上清液中葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量2.4 对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响 复制2.3项中的模型，给药分组为正常组，IR组，二甲双胍组（2 mmol·L-1），5%，10%，15%葛根含药血清分组，每组都补大鼠空白血清至总血清含量为15%，在给药12，15，18，21，24，30，36 h分别采用葡萄糖氧化酶法检测其上清液中葡萄糖含量，参照文献加以改进[9]，以无细胞的空白孔为对照，以起始葡萄糖浓度减去各时间点葡萄糖浓度来计算葡萄糖消耗量2.5 对HepG2细胞活性的影响 IR-HepG2细胞模型建立参照2.3项，细胞分组如2.4项参照文献方法[8]，给药24 h后，每孔加10 μL CCK-8测定液，孵育1 h后，酶标仪检测490 nm吸光度A，计算细胞存活率，细胞存活率=A模型组/A对照组×100%。

2.6 对IR-HepG2细胞糖原含量的影响 复制2.3项中的。