SOD,CAT及POD活性的测定.pdf

测定方法一． SOD，CAT 及 POD 活性的测定分别取 0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入 8 ml 预冷的 50 mmol-1磷酸缓冲液 （pH 7.8）（先加 2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml 离心管，再用6ml 冲洗），10000 rpm 离心 15 min，取上清液定容至10ml 后于 4℃保存上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD 活性及 POD 活性的测定SOD 活性测定1. 显色反应取 5mL指形管（要求透明度好）4 支，2 支为测定管，另2 支为对照管，按表 47–1 加入各溶液混匀后，给1 支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx 日光灯下反应20-30 min( 要求各管照光情况一致，反应温度控制在 25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间) 当样品数量较大时， 可在临用前根据用量将表47– 1 中各试剂 ( 酶液和核黄素除外) 按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变表 47-1 各溶液显色反应用量 试剂酶）用量(mL) 终浓度 (比色时 ) 0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5 130mmol/LMet溶液0.3 13mmol/L 750μmol/LNBT溶液0.3 75μmol/L 100μmol/L EDTA-Na2液0.3 10μmol/L 20μmol/L 核黄素0.3 2.0 μmol/L 酶液0.1 2 支对照管以缓冲液代替酶 液蒸馏水0.5 总体积3.3 3.SOD活性测定至反应结束后， 用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在 560nm下测定各管的OD值，计算SOD 活性3. 已知 SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50% 为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性SOD 总活性 [u/g(FW)]=式中： SOD总活性以酶单位每克鲜重表示比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示ACK ——照光对照管的吸光度AE ——样品管的吸光度VT ——样品液总体积，mL V1 ——测定时样品用量，mL W ——样品鲜重，g蛋白质含量单位为mg/g愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性1.取两支试管，洗涤后甩干水分试剂管号（对照）测定管0.05mol/L PH 5.5 的磷酸缓冲液2.9ml 2.9 ml 2%双氧水溶液0 ml 1.0 ml 0.05mol/L 愈创木酚溶液1.0 ml 1.0 ml 蒸馏水3.0 ml 2.0 ml 总体积7.0 ml 7.0 ml 将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min 以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml 酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。

也可以每分钟读取一次，3 分钟内吸光度变化值ΔA ）2. 结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示按下式计算酶的相对活性△A470 × 酶提取液总量（ml） 酶活性（△ A470·g－1Fw·min－1）= ———————————————————样品鲜重（ g）×测定时酶液用量（ml）过氧化氢酶的活性测定 ——紫外吸收法【原理】H2O2在 240nm 波长下有强烈吸收， 过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1 个； 0.5ml 刻度吸管2 支， 2ml 刻度吸管 1 支； 10ml 试管 3 支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮） ；0.1mol/L H2O2（用 0.1mol/L 高锰酸钾标定） 方法】1.酶液提取： 称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 置研钵中， 加入 2～3ml 4℃下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液5℃下保存备用2.测定：取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管，1 支为空白管，按表40-2 顺序加入试剂表 40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号S1 S2 S3 粗酶液 (ml) 0.2 0.2 0.2 pH7.8 磷酸 (ml) 1.5 1.5 1.5 蒸馏水 (ml) 1.0 1.0 1.0 25℃预热后 ,逐管加入0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中， 240nm 下测定吸光度， 每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全部测定完后，按下式计算酶活性3.结果计算：以 1min 内 A240减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（u） 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FWtV.VAT124010式中A240 = AS0－()AASS122AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml） ；V1—测定用粗酶液体积（ml） ；FW—样品鲜重（ g） ；0.1— A240每下降 0.1 为 1 个酶活单位（ u） ；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min） 。

注意事项】凡在 240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。