细胞色素p450 3a4 1g与腺苷三磷酸结合转运蛋白g超家族成员2基因多态性对羟氯喹血药浓度的影响.doc

细胞色素 P450 3A4* 1G与腺苷三磷酸结合转运蛋白 G超家族成员 2基因多态性对羟氯喹血药浓度的影响 罗雪梅 姚瑶 葛卫红 南京大学医学院附属鼓楼医院药学部 摘 要： 目的 探讨系统性红斑狼疮 (SLE) 患者体内细胞色素 P450 (CYP) 450 3A4与腺苷三磷酸结合转运蛋白 G超家族成员 2 (ABCG2) 基因多态性对羟氯喹 (HCQ) 血药浓度的影响方法 收集 46例系统性红斑狼疮患者羟氯喹全血药物浓度测定数据, 通过 Sanger法测定患者的 CYP3A4*1G (rs2242480) 与 ABCG2 (rs2231142) 基因型, 分析每个基因的多态性对羟氯喹血药浓度的影响结果 患者 CYP3A4*1G各基因型组中, 野生纯合子 (~*1/ *1) 组、突变杂合子 (~*1/*1G) 组、突变纯合子 (~*1G/ *1G) 组的羟氯喹血药浓度分别为 (807.2±455.9) , (705.4±331.9) 和 (229.5±89.8) ng·mL -1, 依次降低GG组和 GA组较 AA组的羟氯喹血药浓度差异均有统计学意义 (均 P0.05) 结论 CYP3A4 *1G等位基因突变可使羟氯喹血药浓度降低, 而 ABCG2等位基因突变对羟氯喹的血药浓度无明显影响。

关键词： 基因多态性; 细胞色素 P450 3A4; 腺苷三磷酸结合转运蛋白 G超家族成员 2; 羟氯喹; 作者简介：罗雪梅 (1987-) , 女, 硕士研究生, 主要从事临床药学的相关研究作者简介：葛卫红, 主任药师, 硕士生导师 MP:13915909299E-mail:6221230@收稿日期：2017-07-28基金：南京药学会-常州四药医院药学科研基金资助项目 (2015YX001) Effects of cytochrome P 450 3A4* 1G and ATP-binding cassette sub-family G member 2 polymorphisms on blood concentration of hydroxychloroquineLUO Xue-mei YAO Yao GE Wei-hong Department of Pharmacy, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School; Abstract： Objective To study the correlation between cytochrome P ( CYP) 450 3 A4 and ATP-binding cassette sub-family G member 2 ( ABCG2) genotypes and the concentration of hydroxychloroquine ( HCQ) in systemic lupus erythematosus ( SLE) patients. Methods Forty-six SLE were recruited and their blood HCQ concentrations were determined. The CYP3 A4 * 1 G ( rs2242480) and ABCG2 ( rs2231142) genotypes were analyzed by Sanger sequencing. The influences of these genotypes on the concentrations of HCQ were studied. Results The blood concentrations of patients with CYP3 A4 * 1 G wild-type homozygous ( * 1/* 1) , heterozygous mutant ( * 1/* 1 G) and homozygous mutant ( * 1 G/* 1 G) were ( 807. 2 ± 455. 9) , ( 705. 4 ± 331. 9) and ( 229. 5 ± 89. 8) ng·mL-1. And the blood concentrations of GG, GT and TT genotypes of ABCG2 were ( 732. 2 ± 424. 4) , ( 764. 5 ± 371. 9) , ( 271. 0 ± 148. 5) ng·mL-1. No significant difference could be shown in patients with ABCG2 genotypes ( P > 0. 05) . Conclusion In SLE therapy, patients with CYP3 A4* 1 G gene exhibit lower blood concentrationsthan the non-carriers. The single nucleotide polymorphisms ( SNPs) ABCG2 do not affect the blood concentration and efficacy of HCQ.Keyword： polymorphism; cytochrome P 450 3A4; ATP-binding cassette sub-family G member 2; hydroxychloroquine; Received： 2017-07-28羟氯喹 (HCQ) 为经典抗疟药, 是临床治疗系统性红斑狼疮 (SLE) 的一线用药。

本研究通过测定长期服用硫酸羟氯喹的系统性红斑狼疮患者的血药浓度及基因型, 研究细胞色素 P450 (CYP) 3A4与腺苷三磷酸结合转运蛋白 G超家族成员 2 (ABCG2) 基因多态性对羟氯喹血药浓度的影响[1-3]材料与方法1研究对象回顾性分析 2014年 6月至 2014年 12月在我院风湿免疫科门诊进行复诊的 46例系统性红斑狼疮患者的病历资料入选标准确诊为系统性红斑狼疮的患者, 汉族, 相互间无血缘关系, 年龄>18岁, 长期 (>6 个月) 规律口服硫酸羟氯喹片 (100 mg, bid) , 并进行过≥1 次羟氯喹血药浓度测定排除标准非系统性红斑狼疮患者, 病例资料不完整者, 肝、肾功能异常者2试剂与仪器血液基因组分 DNA提取试剂盒, 北京天根生化科技有限公司生产;快速热启动DNA聚合酶, 美国卡帕生物系统公司生产;Big Dye 测序反应试剂盒, 美国应用生物系统公司生产1200高效液相色谱仪, 美国安捷伦公司产品;2720 Thermal Cycler 扩增仪, 3730XL测序仪, 均为美国应用生物系统公司产品3全血药物浓度测定[4]采集患者静脉血 3 m L于乙二胺四乙酸 (EDTA) 抗凝采血管中, 振荡混匀, 取200μL 放入 1.5 m L离心管中, 加 10%甲酸乙腈 400μL 进行蛋白沉淀, 分 3次震荡涡旋, 每次 15 s, 然后以 1.4×10r·min离心 6 min, 取上清液 30μL 进样, 通过 HPLC法分析测定羟氯喹血药浓度, 剩余血样编号、记录并-70℃冻存备测基因型。

4基因检测用 TIANGEN基因组提取试剂盒提取患者冻存的血样 DNA根据 Primer 5.0设计CYP3A4*1G与 ABCB2引物序列, 由华大基因科技有限公司完成用扩增仪扩增, 经 94℃预变性 5 min;然后 94℃变性 30 s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 共 35个循环;最后再用 72℃延伸 5 min扩增产物用醋酸钠-乙醇法进一步纯化后, 加入甲酰胺 10μL, 溶解、离心、热变性 (95℃, 2 min) , 冰中骤冷, 上测序仪检测 CYP3A4*1G rs2242480和 ABCB2 rs22311425统计学处理用 SPSS 19.0软件进行统计分析对不同基因型的羟氯喹血药浓度数据进行单因素方差分析 (oneway ANOVA) 结果1一般资料46例系统性红斑狼疮患者的一般资料, 见表 12 等位基因分型结果46例患者中 CYP3A4*1G和 ABCG2等位基因突变频率分别为 32.6%和28.3%Hardy-Weinberg 平衡检验显示, 46 例系统性红斑狼疮患者的CYP3A4*1G与 ABCG2两个等位基因的野生型纯合子、突变型杂合子与突变型纯合子的分布均符合 Hardy-Weinberg平衡 (P>0.05) , 群体处于 Hardy-Weinberg平衡状态, 见表 2。

46 例系统性红斑狼疮患者 CYP3A4*1G与 ABCG2两个等位基因中的野生纯合子、突变杂合子所占比例明显高于突变纯合子3 CYP3A4和 ABCG2基因多态性对羟氯喹血药浓度的影响CYP3A4*1G基因的野生纯合子组、突变杂合子组和突变纯合子组的羟氯喹血药浓度依次降低, 3 组间差异有统计学意义 (P0.05) , 见表 3表 1 46例系统性红斑狼疮患者的一般资料[M50 (min-max) ]Table 1General information of 46 systemic lupus erythematosus patients[M50 (min-max) ] 下载原表 ABCG2基因的野生纯合子组和突变杂合子组的羟氯喹血药浓度均较突变纯合子组高, 3 组间差异均无统计学意义 (均 P>0.05) , 但 GG组和 GT组的羟氯喹血药浓度均明显高于 TT的羟氯喹血药浓度 (均 P0.05) , 见表 3表 2 46例系统性红斑狼疮患者细胞色素 P450 (CYP) 3A4*1G与腺苷三磷酸结合转运蛋白 G超家族成员 2 (ABCG2) 等位基因频率 Table 2 Distribution of CYP3A4*1G and ABCG2 genotypes and allele requencies in 46 systemic lupus erythematosus patients 下载原表 表 3 CYP3A4*1G及 ABCG2基因多态性对羟氯喹血药浓度的影响 (±s) Table 3The influence of CYP3A4*1G and ABCG2 gene poly-morphism on the concentrations of hydroxychloroquine (±s) 下载原表 讨论CYP3A4是人体肝中含量最为丰富的 CYP450酶, 新发现的 CYP3A4*1G为 CYP3A4等位基因中突变频率最高的一个位点。

且 CYP3A4*1G基因多态性可降低 CYP3A4酶的催化活性[5-6]在本研究中, 相比于 CYP3A4*1/*1和 CYP3A4*1/*1G, CYP3A4*1G/*1G患者需要服用更高剂量的硫酸羟氯喹片才能够达到有效的血药浓度[3]ABCG2 是 ABC超家族亚族 G的第 2个成员, ABCG2 基因多态性会影响ABCG2蛋白的表达水平[7-8]且与 ABCG2蛋白的转运活性、膜定位、底物活性等功能有关[9-10]在本研究中, ABCG2 在 SLE患者中的突变率为 28.3%, GG组和 GT组的浓度均明显高于 TT的羟氯喹血药浓度, 但 GG组和 GT组羟氯喹血药浓度差异无统计学意义本研究中对羟氯喹基因多态性与其血药浓度的相关性研究结果发现, CYP3A4*1G等位基因突变可使羟氯喹血药浓度降低, 而 ABCG2等位基因突变对羟氯喹的血药浓度无明显影响可以初步尝试根据 CYP3A4*1G基因型检测结果制定羟氯。