微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色课件.ppt

微 生 物 学 实 验,微生物学实验应当掌握,1、微生物的观察方法（制片、染色、油镜的使用） 2、微生物的培养方法（培养基配制、分装、包扎、灭菌） 3、无菌操作技术（火焰灭菌、倒平板、划线、涂平板、接种）,本课程的成绩考核：,基础实验：60% 由单个实验的成绩相加组成每次实验由实验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进行评定，具体比例为：实验出勤及实验态度占20；实际操作30；实技能考核30；实验报告占20 自主设计实验：40% 设计实验方案 实验操作 总结,实验一 细菌的革兰氏染色,,实验目的 实验原理 实验材料 实验方法 实验结果 注意事项 实验报告 思考题,微生物学实验-1,1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术实验目的,,革兰氏染色法（Gram staining）是微生物学中常用的一种染色方法，该染色法由丹麦医生（Christian Gram）于1884年创立，故名实验原理,,G+细菌,G-细菌,,革兰氏染色机理,G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内，使其呈现紫色。

G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又呈无色这时再经番红复染，就使G-细菌染成红色，而G+细菌仍呈紫色结晶紫初染,,,,全部细胞紫色,,碘液媒染,,,,全部细胞紫色,,乙醇脱色,,,,G- 菌无色 G+ 菌紫色,,番红复染,,,,G- 菌红色 G+ 菌紫色,革兰氏染色各步骤时细菌的外观,,菌种 大肠杆菌 （Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 试剂： 蒸馏水； 草酸铵结晶紫染液 ；卢戈氏碘液 95%乙醇； 番红复染液；香柏油；二甲苯 光学显微镜,实验材料,,革兰氏染色操作步骤,水洗,干燥,镜检（油镜）,,涂片,滴水,取菌,火焰固定,,,,,,结晶紫染色1分钟,,,水洗,碘液1分钟,,乙醇脱色（2030秒）,,水洗,,番红1分钟,水洗,,,,,实验方法,,自然干燥,,,,,,,E.coli,S. aureus,混合菌,,,,,涂片方法示意图,,分辨率 D= 数值孔径 NAnsin,a,n=1.515,空气n=1,,,2NA,2,a,,,,电源,,电源,,,,,,,显微镜油镜的使用与保护,插上电源插头，打开显微镜电源开关。

调节显微镜光源 先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm ，加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察 换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压及装片 观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图 油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯 7. 使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗，关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面金黄色葡萄球菌(G+),大肠杆菌(G-),实验结果,,大肠杆菌(G-) 和金黄色葡萄球菌(G+),,注意事项,1. 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜） 2.染色过程中勿使染色液干涸 3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，会使阳性菌被误染成阴性菌 4. 选用培养1824h菌龄的细菌为宜若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应实验报告,,,,Escherichia coli 10100,Staphylococcus aureus 10100,混合菌 10100,,1通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？,思考题,,实验二 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用,,实验目的 实验原理 实验材料 实验方法 实验结果 注意事项 实验报告 思考题,微生物学实验-1,学习并初步掌握细菌的单染色法。

了解口腔内微生物的种类 掌握油镜的使用方法实验目的,,细菌的单染色法是微生物学中常用的一种染色方法 人体口腔中特别是在牙垢中，有细菌、真菌、支原体、口腔原虫、病毒等数量众多的微生物，用无菌牙签刮取少许牙垢，涂片染色后用显微镜下即可观察到各类微生物的形态实验原理,,试剂： 蒸馏水； 石碳酸复红染液；香柏油； 二甲苯 光学显微镜、灭菌牙签、载玻片,实验材料,,口腔微生物染色操作步骤,干燥,镜检（油镜）,,涂片,滴水,刮取牙垢,火焰固定,,,,,革兰氏染色或 复红染色1分钟,,水洗,,实验方法,,自然干燥,,,实验结果,,,注意事项,1. 载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开 2. 取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱 3. 自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜） 4. 染色过程中勿使染色液干涸实验报告,,口腔中的微生物 10100,,1油镜观察时为何要使用香柏油？油镜的放大原理是什么？为何要等载玻片上的水分完全干燥后才进行油镜观察？ 2谈谈本次实验过后，你对口腔中微生物的认识思考题,,微生物学实验,。