细菌琥珀酸脱氢酶（SDH）活性比色法定量检测试剂盒产品说.doc

1细菌琥珀酸脱氢酶（SDH ）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌琥珀酸脱氢酶（SDH）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成电子受体染料，通过反应系统测定染料还原后峰值的降低，即采用比色法测算样品中单位酶活性的权威而经典的技术方法该技术经过精心研制、成功实验证明的其适合于各种细菌菌株裂解悬液和膜蛋白样品琥珀酸脱氢酶的特异性活性检测用于衰老、能量代谢、蛋白组学、发酵分析等研究产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感技术背景琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循环中与细胞线粒体膜相关的重要元素，位于线粒体内膜，参与细胞呼吸链细菌琥珀酸脱氢酶，又称为SdhCDAB，为膜结合性蛋白，分为周边（peripheral ）和跨膜（transmembrane）部分，其中周边亲水部分由SdhA和SdhB亚体组成：SdhA亚体含有黄素蛋白（flavoprotein） ，是琥珀酸的活性部位；SdhB含有铁硫蛋白（ iron-sulfur protein） ，进行电子传递；跨膜疏水部分由 SdhC和SdhD亚体组成：SdhC含有亚铁血红素 -B（Heme-B ） ，SdhD含有泛醌（ubiquinone）结合部位（Q部位） 。

其作用在于参与三羧酸循环（TCA cycle）和呼吸链活动琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸（succinate）的氧化反应，产生延胡索酸（furmarate） ，通过黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）传递电子基于琥珀酸脱氢酶的反应原理，使用人工电子受体染料二氯靛酚钠（2,6-Dichloroindophenol sodium ；DCIP） ，接受来自还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH 2）的电子，而被还原，在分光光度仪下，其吸光值（600nm波长）的变化，来测算琥珀酸脱氢酶的活性其反应方式为：产品内容裂解液（Reagent A） 毫升活性液（Reagent B） 微升缓冲液（Reagent C） 毫升反应液（Reagent D） 毫升底物液（Reagent E） 毫升阴性液（Reagent F） 微升产品说明书 1 份保存方式保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融； 反应液（Reagent D）含有毒性物质，避免直接用手接触； 底物液（Reagent E） ，避免光照；有效保证 3 月2用户自备15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5 毫升离心管：用于样品操作和保存的容器超声仪：用于裂解细菌细胞（微型）台式离心机：用于样品操作恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育比色皿：用于比色测定的容器分光光度仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化； 底物液（Reagent E）注意避光。

然后进行下列操作一、样品准备1． 准备好 10 毫升待测的细菌放进 37℃摇床孵育 16 小时，速度为 220RPM2． 直至 OD600＝0.4 至 0.8，即 1 至 2 X 107 细胞/毫升3． 置于冰槽里 5 分钟4． 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 1000g5． 小心抽去上清液6． 加入 xx 微升 裂解液（Reagent A） ，充分混匀7． 转移到预冷的 1.5 毫升离心管8． 加入 xx 微升 活性液（Reagent B）9． 强力涡旋震荡 15 秒10． 至于超声仪下超声处理：100 功率，20 秒超声一次，冰上间隙 1 分钟，重复 3 次11． 放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 500g12． 小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管13． 移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意： 建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－ 30030.1）14． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备1． 准备好待测样品，置于冰槽里 2． 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长 600nm，间隔 60 秒，读数 6 次（共 5 分钟） ，并置零 3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度三、背景对照测定1． 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2． 加入 xx 微升 反应液（Reagent D）3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent E）4． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟35． 加入 xx 微升 阴性液（Reagent F）6． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：OD0 分钟－OD 5 分钟 四、样品活性测定1． 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2． 加入 xx 微升 反应液（Reagent D）3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent E）4． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟5． 加入 100 微升待测样品（注意：10 微克总膜蛋白或 100 微克细菌总蛋白；样品须溶解 ）6． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：OD0 分钟－OD5 分钟五、计算样品活性注意事项1． 本产品为 20 次操作，包括背景对照测定2． 操作时，须戴手套3． 反应液（Reagent D）含有毒性物质，避免直接用手接触4． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次5． 加入样品后 3 秒内即刻比色测定6． 比色测定初始读数（0 分钟读数）0.8 左右为理想状态7． 反应 1 分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定持续 5 分钟8． 测定值由高到低变化，即 5 分钟测定读数低于 0 分钟测定读数，表明有酶活性9． 比色测定后，比色皿须清洗彻底10．建议待测样本周膜蛋白浓度为 10 微克/100 微升和细菌总蛋白浓度为 100 微克/100 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 细菌可溶性膜蛋白制备试剂盒 30022.2 和 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1）11．活性计算时，可以选择 5 分钟内单位时间最大线性变化的吸光值12．琥珀酸脱氢酶单位活性定义为：在 30℃，pH 7.5 条件下，每分钟内能够还原 1 微摩尔氧化型二氯靛酚钠（DCIP ）所需的酶量作为一个活性单位13．本公司提供系列琥珀酸脱氢酶技术产品 质量标准1． 本产品经鉴定性能稳定2． 本产品经鉴定检测准确。