酵母培养操作规程.doc

酵母培养操作规程團本文主要介绍酵母的选育、保种、培养的操作工艺等目录第一章酵母扩培…………………………………………………………………（2）§1-1实验室扩培…………………………………………………………………（2）1 培养基制备……………………………………………………………………（2）2 接种操作………………………………………………………………………（3）§1-2生产现场扩培……………………………………………………………（5）1 准备工作………………………………………………………………………（5）2 汉生罐接种操作………………………………………………………………（5）3 扩大罐扩培……………………………………………………………………（5）4 二次（车间）扩大罐扩培……………………………………………………（6）第二章菌种保藏…………………………………………………………………（7）1 实验室菌种保藏与活化……………………………………………………（7）2 汉生罐菌种保藏与活化……………………………………………………（7）第三章酵母检测…………………………………………………………………（8）§3-1取样……………………………………………………………………（8）1 扩培液、发酵液及待滤酒等的取样…………………………………………（8）2 酵母泥的取样…………………………………………………………………（8）§3-2检测…………………………………………………………………（10）1 酵母细胞形态检测……………………………………………………………（10）2 酵母细胞大小测定……………………………………………………………（10）3 酵母泥外观检测………………………………………………………………（11）4 酵母细胞数和出芽率的测定（血球计数板法）……………………………（11）5 酵母死亡率的测定（血球计数板法）…………………………………………（12）6 酵母肝糖染色法……………………………………………………………（13）7 酵母凝聚性的测定…………………………………………………………（14）8 酵母死灭温度的测定……………………………………………………………（15）9 酵母发酵失重实验……………………………………………………………（16）10酵母的呼吸缺陷型检测（16）第一章酵母扩培§1-1实验室扩培1培养基制备【试剂】：冷麦汁、蒸馏水、新鲜鸡蛋。

器具】：试管（15x150）及（18x180）、小巴氏瓶（三角瓶）、大巴氏瓶（大三角瓶）、卡氏罐、中速滤纸、电炉、量筒、不锈钢锅、糖度计等仪器】：杀菌锅、天平（精度0.1g）方法】〖试管、三角瓶及巴氏瓶培养基的制备〗① 取样：取糖化冷却麦汁，视麦汁浊度情况判定是否进行过滤2°C,按每0.5~1L使用一个鸡蛋的比例，加入打成泡沫的蛋清，在不断地搅拌下保温30min；然后升温煮沸30min；将煮沸后的麦汁用水浴冷至80~90C，用双层中速滤纸过滤②澄清：将麦汁加热至450.2°P③调糖：将过滤后的麦汁用蒸馏水调整糖度为11④分装：试管（15x150）5mL，试管（18x180）10mL，分装小巴氏瓶（三角瓶）、大巴氏瓶（大三角瓶）⑤灭菌：分装后包扎好，115C杀菌20min；杀菌后培养基放置2~3天，确定无菌后备用〖卡氏罐培养基的制备〗取糖化冷却麦汁（有条件的可取薄板前热麦汁）加入卡氏罐，然后封闭卡氏罐取样口，各呼吸阀等接口处均应以棉塞或呼吸阀进行封闭后包扎结实，115C杀菌30~40min,于室温冷却至17~18C；接种前以3L/min的速率充纯氧2~3min（卡氏罐有效容积20L）2 接种操作【器具】：酒精灯、酒精棉、剪刀、接种针、镊子、定量移液器或吸管等。

仪器】：超净工作台等方法】无菌室使用前，使用紫外线灯照射20~30分钟进行杀菌；进入无菌室换无菌工作服；所有操作采用无菌操作〖活化〗① 操作前将冷冻管菌种置于室温下，使之内部培养基达到室温后，振荡均匀；无菌操作，将冷冻管内的培养液全部转入盛有5mL培养基的试管中，于25±1C培养72±2小时② 将试管中的培养液轻轻振荡均匀，用接种环接取三环加入另一支盛有5mL培养基的试管中，于25±1C培养24~36小时③ 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀，用无菌吸管接0.1mL加入盛有10mL培养基的试管，振荡均匀后于25±1C培养24~36小时〖扩大〗① 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀后，全部接入小巴氏瓶（三角瓶），每个小巴氏瓶（三角瓶）接入一支试管的培养液；然后于23±1C培养24~36小时② 将培养结束的小巴氏瓶（三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入大巴氏瓶（大三角瓶），每个大巴氏瓶（大三角瓶）接入一只小巴氏瓶（三角瓶）的培养液；然后于21±1C培养24~36小时③ 将培养结束的大巴氏瓶（大三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入卡氏罐，每个卡氏罐接入两只大巴氏瓶（大三角瓶）的培养液；然后于18±1C培养24~36小时。

〖注〗：除卡氏罐外，其它液体培养基在接种后每12小时应振摇一次，以去除二氧化碳，保证酵母耗氧需求实验室扩培工艺】容器扩大倍数培养温度C培养时间hr冷冻管®液体试管活化25±172±2液体试管活化25±124~36液体大试管活化25±124~36小巴氏瓶（三角瓶）1023±124~36大巴氏瓶（大三角瓶）1021±124~36卡氏罐1018±124~36注：1.试管至三角瓶阶段，至少多做1-2个（支）备用，防止出现意外情况，影响扩培2.卡氏罐接种前充纯氧，充氧速率3L/min，2-3min§1-2生产现场扩培1 准备工作设备准备】：每次扩培前应将待使用的自糖化至汉生罐、扩大罐的管路及汉生罐、扩大罐、连接管路、空气滤器进行刷洗和灭菌培养基灭菌】：取糖化冷却麦汁（有条件的可取薄板前热麦汁）加入汉生罐或扩大罐，进行升温杀菌通常在常压下保持沸腾30~40min即可杀菌后用无菌空气备压0.05MPa后降温至14±0.5°C备用2 汉生罐接种操作接种】：将杀菌麦汁接入汉生罐后，再将已扩培好的卡氏罐菌种接种至汉生罐，扩培比例为1:10~15通风】：保证酵母生长对氧的需求，具体通风量根据酵母生长情况调整，若酵母细胞内出现空泡较多或细胞拉长现象，应适当增减通风量。

温度】：接种前控温在14±0.5C，接种后培养液自然升温至16C,并保持16±0.5C进行培养备压】：接种前备压0.05MPa,接种后保持罐内正压培养时间】：接种后培养36~48hr，待细胞浓度达到35~40x106个/mL方可转罐检测】接种前的无菌麦汁及接种后的培养液，应作微生物检测3 扩大罐扩培接种】：扩大罐内接入冷麦汁（杀菌或不杀菌，保证麦汁无菌），将汉生罐内的培养液充分搅拌后，全部压入扩大罐（扩大比例1:5~6）通风】：具体通风量根据酵母生长情况调整，若酵母细胞内出现空泡较多或细胞拉长现象，应适当增减通风量酵母起发后，应将流量和通风时间适当减少温度】：麦汁温度为12±0.5°C，自然升温至14°C,并于14±0.5°C控温培养备压】：接种前备压0.05MPa,接种后保持罐内正压培养时间】：培养24~36hr，待酵母数达到35~40x106个/mL以上时，即可进行下一步扩培4 二次（车间）扩大罐扩培将扩大罐的培养液充分搅拌后，全部压入二次（车间）扩大罐（扩大比例1:3~4）再向二次（车间）扩大罐进充氧冷麦汁或对培养液进行适度通风（麦汁含氧量8mg/L以上），料温控制11±0.5°C，接种后自然升温至12C，并于11~12C保温培养；压力维持罐内正压；培养24±2hr，待酵母数达到35~40x106个/mL以上时，即可进行追加麦汁或移入发酵罐进行繁殖。

车间扩大培养工艺】容器扩大倍数培养温度C培养时间hr充氧状况卡氏罐®汉生罐10~1516±136~48根据情况进行调节扩大罐5~614±124~36根据情况进行调节二级扩大罐3~412±124±2充氧麦汁浮选罐或发酵罐1~210±124±2充氧麦汁发酵罐追加满罐约1工艺控温24±2充氧麦汁第二章菌种保藏1实验室菌种保藏与活化【形式】：保种形式分为冷冻保种管和固体斜面保藏两种〖冷冻保种管〗：青啤酵母以冷冻保种管的形式提供，-20~-25C保藏，一次扩培使用一支〖固体斜面〗① 保藏：其它酵母菌种以固体斜面形式0~4°C冷藏保藏，定期活化；② 活化：每三个月活化一次接一环斜面菌种于5mL麦汁液体培养基中，于25±1C培养24~36小时;待酵母起发后，将培养液振荡均匀，用接种环涂划固体斜面，于?5±1°C培养60~72小时；然后于0~4C冷藏保藏③ 固体斜面菌种每年更换一次2汉生罐菌种保藏与活化【保种操作】① 可将正在扩大培养的培养液由扩培罐压回至汉生罐，或直接将汉生罐的菌种留约1/5扩培液追加杀菌麦汁进行保种②培养48~72小时后，至糖度降至7~8°P时，迅速将温度降至2~4°C进行保种，压力为0.05MPa。

每月更换一次麦汁进行活化，汉生罐菌种使用及活化次数总共不超过8次活化操作】① 将扩培罐麦汁杀菌降温至12~13C备用② 将汉生罐内培养液通风搅拌后，全部转移至扩大罐中（扩大比1:5~6），于14±0.5C进行培养，保持罐内正压，通风同扩培③ 待酵母数达到30x106个/mL以上时，将待留种的培养液打回汉生罐，按【保种操作】②条操作剩余扩培液可打入发酵罐第三章酵母检测§3-1取样1扩培液、发酵液及待滤酒等的取样【器具】取样瓶、便携式喷灯、酒精喷雾器或酒精棉、打火机；【方法】① 将取样阀用75%的酒精棉擦拭或酒精喷雾器喷洒酒精，用便携式喷灯或点燃酒精棉灼烧取样口（灼烧适度，避免损伤内部胶垫），进行清洁和灭菌；② 然后打开取样阀，放出约1000mL液体，关闭取样阀；③ 再次用酒精棉擦拭后，先打开取样阀，调整合适的流速，防止液体在取样时迸溅，用取样瓶接取样品约300mL，封闭取样瓶口；④ 关闭取样阀，用酒精喷雾器喷洒酒精或用酒精棉擦拭，对其进行清洁和灭菌2酵母泥的取样【器具】取样瓶、便携式喷灯、酒精喷雾器或酒精棉、打火机；【方法】A回收罐的取样① 将取样阀用75%的酒精棉擦拭或酒精喷雾器喷洒酒精，进行清洁和灭菌；② 然后打开取样阀，放出约1000mL酵母泥，关闭取样阀；③ 先打开取样阀，调整合适的流速，防止酵母泥在取样时迸溅，用取样瓶接取样品约200mL后，封闭取样瓶口；④ 关闭取样阀，用酒精喷雾器喷洒酒精或用酒精棉擦拭，对其进行清洁和灭菌。

B锥形罐的取样① 将锥底阀用75%的酒精棉擦拭或酒精喷雾器喷洒酒精，进行清洁和灭菌；② 然后打开锥底阀，放出底部掺有凝固物的酵母泥，至流出洁白的酵母泥时关闭锥底阀；③ 再次用酒精棉擦拭后，先打开锥底阀，调整合适的流速，防止酵母泥在取样时迸溅，用取样瓶接取样品约200mL后，封闭取样瓶口；④ 关闭锥底阀，用清水将阀内冲洗干净§3-2检测1酵母细胞形态检测【适用】扩培液、发酵液、待滤酒、酵母泥等【原理】在酵母菌的各个生长时期，利用显微镜对酵母细胞的外形及内容物等进行观察器具】显微镜、载玻片、盖玻片等方法】① 样品取回后，应立即进行检测；若。