
平滑肌细胞原代培养、传代、冻存方法及所需试剂.docx
8页01 年 中国现代医学杂志 贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制 DMEM(美国 Corning Cellgro 公司),Hepes(15mmol/L),青霉素 (100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲 胎牛血清)1.1.2 培养器皿 25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养 皿1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验 动物中心提供,雌雄不拘,体重150〜180g动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌 条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理 盐水中每次取材 2〜3 只大鼠贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织, 剥除动脉外膜纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余 血管中膜组织较薄、透明、韧性好用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗 ,去除 脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞 ,然后将一次取材 的 2〜3 条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。
滴加少许培养液使组 织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mmx1mm大小的组织块并剪切好的组织 小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上 并向瓶内注入适量培养液,于37°C孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附 后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3〜5d待有 细胞从组织块周围游出后换液1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻 细胞的细胞晕接触时即可传代加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面 ,室 温下大约1~2mi n,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶 使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹 打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液将细胞悬液一分为二接种到新的培 养瓶中,补足培养液(每瓶3〜4ml)未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去1.3 培养细胞的鉴定1.3.1 形态学 用相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律 ,并依常规制作 电镜标本进行观察1.3.2免疫组织化学鉴定特异性鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(福建迈 新生物技术公司),采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色。
a-SM-actin免 疫组织化学鉴定)04 协和 中国动脉硬化杂志 胰酶消化法培养平滑肌细胞1.1 试剂和动物胰酶购自Corning Cellgro公司a -actin抗体购自中山生物技术有限公司;PBS购自 Corning Cellgro;新生小牛血清购自 HyClone, DMEM 为 Corning Cellgro 产品雄 性Wistar大鼠(2只,体重175±25 g)购自中国医学科学院实验动物中心1.2 胰酶消化法原代培养Wistar大鼠处死,迅速取出胸主动脉,浸泡在含无菌PBS的表面皿中,转移到无菌超 净台在表面皿中漂洗主动脉去除残留的血迹,纵向剪开主动脉,把主动脉铺平并 使内膜朝上,用镊子来回刮除内膜层,剥离血管中膜将剥离的血管中膜用眼科剪 剪碎,碎片大小在1 mmxl mm左右装入含0.25%胰酶的玻璃培养瓶中于37°C条 件下消化当在显微镜下观察组织块表面出现大量细胞时应立即加入血清终止消 化,一般消化的时间在3.5 h终止消化后将玻璃培养瓶置于37C空气摇床振摇10 min,继续用吹打的方法使组织块表面的细胞尽可能脱落待细胞从组织块脱离 后,120目细胞筛过滤,转入离心管内离心,弃上清,用含20%小牛血清的DMEM培 养基吹打细胞,最后接种于25 mL培养瓶,放入CO2孵箱培养,48 h后换液。
1.3 传代培养细胞融合后,倒去旧的培养液,加入适量的 0.25%胰酶,显微镜下观察,见细胞收缩 后去除消化液,加入适量培养液,吹打细胞,以1 : 2接种于新培养瓶中,补足培养液,放入37C、 5%CO2孵箱培养传代细胞从第三代开始可换用含10%小牛血清的DMEM培 养基培养°VSMC至少可以传16代以上,并且从第二代开始平滑肌细胞即可冻存1.4 动脉平滑肌细胞的鉴定 相差显微镜下,细胞未汇合之前多数呈梭形,至汇合后,部分区域细胞束状排列,呈 典型的“峰和谷”状态将传代获得的平滑肌细胞接种于盖玻片上,3~4天后至亚汇 合状态,取出细胞爬片,PBS清洗后用4C纯丙酮固定15~30 min,自然晾干采用 小鼠抗大鼠a-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定VSMC肌动蛋白根据S-P 免疫组织化学染色的常规方法,以平滑肌细胞胞浆棕黄色为阳性结果05 重庆医学/基础医学与临床1 材料与方法1.1材料9~12d新生健康清洁级KM小鼠,雌雄不限,购自重庆医科大学实验动 物中心RPMI-1640干粉培养基,D-Hanks粉,标准胎牛血清(购自上海普飞生物 公司澳洲胎牛血清),胰蛋白酶粉(1 : 250)均购自Corning Cellgro公司;青霉素钠、 硫酸链霉素购自华北制药厂;鼠抗兔平滑肌a肌动蛋白单克隆抗体,购自Zymed公 司;SP免疫组化试剂盒,DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司。
1.2 细胞培养 断颈处死小鼠,75%乙醇浸泡消毒2min,分离取出胸主动 脉,D-Hanks液清洗去除血污,获干净光滑的血管段,用眼科镊固定血管段端,刀片 轻刮去外膜结缔组织,再用眼科剪小心剖开血管,刮去内膜层细胞,将血管段剪成 1mmx1mm大小的组织块,均匀贴放于25ml培养瓶底面,组织块间隙约2~3mm,加 入含10%胎牛血清的1640培养液2~3ml,轻晃培养瓶使培养液掠过组织块,翻转静 置于37C、5%CO2培养箱中3~4h,再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中,半 开放式绝对静置培养 3d,4~5d 时首次换液当组织块周围外长的细胞相互汇合, 逐渐铺满整个瓶底时,需进行首次传代:吸弃旧培养液,D-Hanks液2ml清洗后吸弃, 加0.25%(g/L)胰酶液2ml在37C下消化,2〜5min后镜下观察,当细胞回缩、间隙增 大时,吸弃胰酶液,加入含10%胎牛血清的1640培养液4~6ml终止消化,反复吹打 瓶壁细胞,形成的细胞悬液按 1: 2 接种(消化后脱落的组织块可一并传入新培养 瓶中)以后的传代方法相同,传代周期为 5〜7d1.3 细胞纯化1.3.1 自然纯化法 由于进行了前期的血管预处理(去除了大部分内膜和外膜组 织),原代培养时虽为多种细胞混杂生长,但平滑肌细胞仍占绝大多数。
随着传代次 数的增加,平滑肌细胞可排挤其它细胞的生长而优势增殖1.3.2 机械刮除法 虽然去除了大部分内膜组织,但培养中仍可见内皮细胞的小 范围生长传代前在镜下用记号笔在培养瓶表面划出内皮细胞生长区域 ,用弯头 吸管在该区域内反复推刮、破坏细胞,吸弃培养液后再进行传代1.3.3 差异贴壁法 残留的内膜和外膜组织中含有少量的成纤维细胞 ,参阅李悦 梅等⑴的方法去除:传代时,将消化吹打形成的细胞悬液静置15m in,使部分细胞 贴壁,转移培养液至下一个培养瓶中,再次静置、贴壁,重复上述步骤 1~2 次,最后一 个培养瓶中可获较纯的平滑肌细胞根据不同细胞贴壁的时间差纯化细胞) 1.4 细胞鉴定1.4.1 形态学观察 应用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列 方式等1.4.2 免疫细胞化学染色 将第 5 代对数生长期的细胞悬液接种到预先放置 2 张7mmx22mm盖玻片的培养瓶中,培养2〜3d后,取出盖玻片,PBS漂洗5minx3 次,4%多聚甲醛室温下固定20〜30min,PBS再次漂洗5minx3次,然后按照SP免疫组化试剂盒和DAB 显色试剂盒说明书逐条进行操作(一抗是鼠抗兔平滑肌a肌动蛋白单克隆抗体)。
细胞培养的几点技巧:①相同条件下,小龄动物较大龄动物的组织块有更好的增殖 潜能,但动物体积过小又存在取材困难,组织量少的问题,采用 9〜12 d 新生小鼠取 材,既能对血管进行顺利操作,又能保证约90%的组织块有细胞外长②细胞生长 具有接触抑制和密度依赖性,一般取 2〜3 只小鼠的胸主动脉组织块均匀接种于 25 mL培养瓶中,间隙约2~3 mm当部分组织块周围细胞密集、重叠,停止增殖时, 即使整瓶细胞未达到传代标准,仍可用酶消化,吹散密集细胞,1 : 1方式传代生长③原代培养初期,当部分组织块漂浮未贴壁,可将其重新摆放至瓶底,翻转干涸2~3 h 后,再浸没于培养液中,使其重新贴壁该法不会影响同瓶中其他已萌出细胞的 生长④小鼠主动脉极细,操作时动作一定要轻柔,避免对血管的过度损伤一般 受牵拉少,剪切时边缘整齐圆滑的组织块萌出细胞的概率较大⑤细胞传代时,酶 消化时间不应固定或硬搬他人经验 ,应在镜下观察,至胞质回缩,间隙增大时及时 终止消化细胞原代培养的常用方法有酶消化法和组织块法,酶消化法培养周期短,但酶作用 时间不易掌握,且消化酶本身对培养细胞有毒性作用 ,可致培养失败;组织块法虽 培养周期相对较长,但操作简便,污染机会小,培养效率高[3,4]。
本研究中由于新生 小鼠主动脉细小,可供培养的组织量少,于是采用了组织块培养法07 滨州医学学报 改进的脐动脉血管平滑肌贴块培养法用 DMEM 培养液反复冲洗,以去掉血管内外的血迹,用眼科镊小心分离下动脉外 的结缔组织及血管外膜,然后用眼科剪纵向剪开血管,再用眼科剪将中膜和内膜剪 成约 1〜2 mm2 大小的组织块,用弯头吸管将血管小块移入 25 cm2 塑料培养瓶,并 以4~7块/cm2的密度均匀排列于 培养瓶底(培养瓶底提前用培养液湿润),翻转后加入含有青霉素和链霉素及 20% 胎牛血清的DMEM培养液约3〜5 m,l放入37°C、5%CO2培养箱内(湿度100% ), 贴壁 2〜3 h 后再轻轻翻转培养瓶,使组织块浸入到培养液中,开放式培养,一周后取 出观察并换液1.2. 2 胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的传代培养:细胞生长融合后,用 0. 125%的胰 蛋白酶消化传代先将胰蛋白酶放入37C水浴箱预热用吸管将组织块从培养 瓶底轻轻吹打下来,可以将组织块重新移入另一培养瓶继续贴块法培养用无血 清的培养液将培养瓶底冲洗两遍,洗掉残留的血清,然后迅速加入预热的胰蛋白酶, 放回培养箱,每隔 2 min 观察一次,并轻轻拍打培养瓶壁,使细胞从瓶底脱落下来, 待镜下观察多数细胞收缩变圆后,向培养瓶中加入含血清的培养液,终止胰蛋白酶 的作用,再用吸管轻轻吹打培养瓶底,使细胞脱落,然后将培养瓶中的液体移入离心管,500 r/min,离心10 min后,弃上清液,然后加入含有10%胎牛血清 的培养液将沉淀制成均匀的细胞悬液,按1:2的比例将细胞悬液移入培养瓶,放 回培养箱继续培养。
1. 2. 3 血管平滑肌细胞的鉴定:取常规传代的细胞,制成均匀的细胞悬液后 ,移入放有盖玻片的培养皿中培养 ,待 细胞贴壁伸展,生长良好后取出盖玻片,用PBS冲洗2遍,凉干,放入4%的多聚甲醛 中固定, 30% H2O21 份+纯甲醇50份混合,灭活内源性过氧化物酶,然后热修复抗 原,再分别滴加5%BSA封闭液、一抗[即抗平滑肌a-肌动蛋白(a-actin)的单克隆抗 体]、生物素化山羊抗小鼠IgG、试剂SABC,最后DAB显色,苏木素复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微 镜下观察2 结果2. 1 体外培养的胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的形态观察 实验中观察到脐动脉 组织块贴壁后 5~7d 可见有细胞以垂直方向从组织块周围游走出来(见图 1),但并 不是所有的组织块周围都有细胞游出,离组织块较远的区域也可以。












