《DNA的复制》PPT课件.ppt

第第3章章   DNA复制复制  (DNA  Replication)      3.1.        基基 本本 概概 念念 遗传物质的分子机制遗传物质的分子机制分子生物学的核心分子生物学的核心Watson & Crick:Watson & Crick: 遗传物质必须能行使两种功能，遗传物质必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的自我复制 基因的突变基因的突变 控制性状的表达控制性状的表达DNA复制复制       亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以     每单链每单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自身碱基可以互补     配对的游离的配对的游离的dNTP,dNTP,  合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNADNA分子完分子完     全相同的子代全相同的子代DNADNA分子的过程。

分子的过程 ● 复制子复制子 ● 复制体复制体 一个一个DNADNA复制起点所控制的复制起点所控制的DNADNA序列称为复制子，即序列称为复制子，即复制起点复制起点原核生物的复制子通常为原核生物的复制子通常为一个一个，而真核生物则，而真核生物则为为多个多个 是在复制叉组装的是在复制叉组装的蛋白质复合体蛋白质复合体，负责，负责DNADNA的合成包的合成包括括DNADNA聚合酶、引发体、聚合酶、引发体、SSBSSB、解旋体等解旋体等DNA DNA 复制在细胞周期复制在细胞周期S S 期期E.coli 37 ℃0.5 h105 bp/min    S 6-8hs M 1hG23-4h哺乳动物细胞哺乳动物细胞22-25h500-5000 bp/min G112h•   复制机理的复杂性复制机理的复杂性  双链双链DNA单链单链 DNA 能量的供求能量的供求构型的变化构型的变化超螺旋超螺旋线状，开环状线状，开环状多种酶类的互作多种酶类的互作复制体复制体DNA复制起始控制机理知之甚少复制起始控制机理知之甚少复制的准确性复制的准确性（修复，校正）（修复，校正）研究材料的特殊性研究材料的特殊性（温度敏感型，突变抑制体系）（温度敏感型，突变抑制体系）DNA复制速度复制速度(E.coli 105 bp/min，高速解旋，高速解旋 112 km/h ?)缺乏统一的模式缺乏统一的模式(双链双链 DNA,  单链单链 DNA,  线型线型 DNA….)  DNA复制的特点复制的特点★★ 半保留复制半保留复制★★ 有一定的复制起始点有一定的复制起始点★★ 需要引物需要引物    原核生物原核生物50-100bp，真核生物，真核生物10bp★★ 双向复制双向复制★★ 半不连续复制半不连续复制3.2.     复制起点与方向复制起点与方向oriC的分离的分离DNA复制的起点复制的起点（（origin of replication, ori））转化缺乏转化缺乏Ampr基基因的因的E.coli受体菌受体菌复制起点的特征复制起点的特征J. W. Zyskind 克隆到克隆到E.coli oriC确定其最小区段为确定其最小区段为245bp，，并与沙门氏菌等并与沙门氏菌等4种细菌的种细菌的oriC序列进行比较分析发现序列进行比较分析发现；；• 具有具有245bp245bp富含富含 AT AT的区域，该区域是的区域，该区域是 DNA DNA 聚合酶结聚合酶结合的位点。

合的位点oriCoriCRNA 聚合酶发动引物聚合酶发动引物大肠杆菌大肠杆菌沙门氏菌沙门氏菌肠杆菌肠杆菌克雷伯杆菌克雷伯杆菌胡萝卜欧氏杆菌胡萝卜欧氏杆菌真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的富含富含AT• “呼吸呼吸现象现象”        DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，复制原点处氢键迅速断裂与再生，      导致两条导致两条DNA链不断解链与聚合，链不断解链与聚合，      形成瞬间的形成瞬间的单泡状结构单泡状结构的过程        在富含在富含AT的区域内尤为明显的区域内尤为明显           常温（常温（37℃）即可发生解链）即可发生解链• 复制起点两侧基因的转导频率高复制起点两侧基因的转导频率高 4a 4b 3c 3d 2e 2f 1g 1h                           a         o         b                   c     a         o         b      d           e      c     a         o         b      d        f          g       e      c     a         o         b      d        f         h 复制起点复制起点大多数大多数 rDNA 位于复制起点两侧位于复制起点两侧•  子链子链DNA延伸方向延伸方向 DNADNA聚合酶只在聚合酶只在DNADNA新链的新链的3’-OH3’-OH端反应；端反应；                  OHT  C AT  C A   C                         OH  3’DNADNA新链的延伸方向为新链的延伸方向为 5’ → 3’ 5’ → 3’ 。

ppp        OH C++      ppi 5’PPP5’PPP聚合反应聚合反应DNADNA聚合酶只能把聚合酶只能把单核苷酸单核苷酸5 5’’磷酸磷酸加到上一个核苷酸加到上一个核苷酸的的3 3’’羟基上，结羟基上，结合成链合成链进化中保留的进化中保留的最经济、最有最经济、最有效的方法效的方法 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是  3’ → 5’ A    T     C   G  +     5’ ppp                             OH  3’   G  ppp       OH     G   A     T     C   G     5’  ppp                                    OH  3’  A    T     C   G  +     5’ ppp                             OH  3’   G  ppp       OH                  G       5’  ppp因能量的需要，因能量的需要， DNA的的5’ 端必须带有端必须带有PPP游离游离dNTP具有具有pppppp                            OH  3’  A     T     C   G 在在0.2M Nacl 的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到难以聚合到DNA的的5‘端，而且端，而且 双链双链DNA的的5’端碱基配对困难端碱基配对困难               需要其他机制以解脱需要其他机制以解脱  碱基发生错配后的校正碱基发生错配后的校正…… 费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗 A   T   C   G ppp                        OH+ pppAp                  OHT   C   Gppp                  OH T   C   GT   C   Gpp p                  OH 3.3.  DNA的半保留复制的半保留复制三种复制方三种复制方式假说式假说全保留复制半保留复制弥散型复制离心离心离心(CsCl (CsCl 密度梯度离心密度梯度离心) ) N15   N14 DNADNADNA半保留复制半保留复制M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.3.4   DNA半不连续复制半不连续复制 DNA 在冈崎片段复制在冈崎片段复制 1kb5‘3‘5‘3‘（半不连续复制（半不连续复制 ）） 1kb1kb1kbDNA半不连续复制半不连续复制 DNA半不连续复制半不连续复制 证据证据 • DNA DNA中中dumpdump片段片段dUTP dUTP : dTTP : dTTP = 1  ：：300  细胞中细胞中  ---A---- ---T--------G --------C----AUGUdut 基因基因 dUTPase 少数少数dUTPdUTP DNA 中不能有中不能有U ?---A-------T----突变频率 = 1/1200 ！？---A--- ---A--- ---U--- --- --- Ungase  ungU尿嘧啶尿嘧啶-N-糖基酶糖基酶 UU变性变性 临时片段临时片段~ 1200 bp~ 1200 bp~ ~ 冈崎片段冈崎片段●      ung – 临时片段越长临时片段越长●      dut – 临时片段越短临时片段越短AA DNA DNA 半不连续复制半不连续复制 先导链，滞后链先导链，滞后链 均有均有 dUMPdUMP 的掺入的掺入 冈冈崎崎片段片段在某种意义上为在某种意义上为 dUMP dUMP 片段片段 先导链按先导链按 dUMPdUMP 片段连续复制片段连续复制后随链按后随链按冈崎片段冈崎片段不连续复制不连续复制( 原核生物. 1-2kb, 真核生物. 0.1-0.2kb )3.4.   DNA复制的模式复制的模式• 复制的多模式复制的多模式 单单起点、起点、单单方向方向多多起点、起点、单单方向方向单单起点、起点、双双方向方向多多起点、起点、双双方向方向DNA复制的模式复制的模式● 双向复制双向复制● 单单向复制向复制● 滚环滚环复制复制（（σ复制）复制）● 双向复制双向复制E.coli复制的复制的θ 模型模型● 单单向复制向复制E.coli E1单向复制单向复制DNA复制方向复制方向RNA引物引物● 滚环滚环复制复制• DNA复制的引物复制的引物 DNA聚合酶不能发动聚合酶不能发动子链子链DNA的复制起始的复制起始 !E.coli[利福平利福平 s ][利福平利福平 S ]  +  M13E.coliE.coli[ 利福平利福平 R ]M13+                                                                单链单链 DNA 病毒病毒+复制复制无M13 复制利福平M13利福平利福平有有M13 复制复制有有M13 复制复制 M13 利福平利福平利福平 是是E.cE.colioli RNA RNA 聚合酶聚合酶的抑制剂的抑制剂 • M13 M13 复制子的形成需要复制子的形成需要 RNARNA聚合酶聚合酶发动合成一段发动合成一段 RNA   分子作为引物；分子作为引物； •  复制启动后，复制启动后，RNA引物已经形成，引物已经形成， 利福平的抑制无效。

利福平的抑制无效总结：总结：    第一次证明了第一次证明了RNA 引物的存在引物的存在   Dnase降解前降解前      DNase 降解后降解后DNA/RNA 引物冈崎片段引物冈崎片段引物GTP用用 [32p]标记，标记，用用Dnase酶降解酶降解DNA，只留下标，只留下标记的引物记的引物                                      DNase 不能完全降解冈崎片段不能完全降解冈崎片段Tuneko Okazaki J. Mol. Biol. 184 (1985) p. 49P32标记标记13 bp的的 RNA 引物引物● 新起始方式新起始方式 或或 复制叉式复制叉式（（replication replication forkfork））复制起点复制起点 (θ (θ模型模型) )→ RNA → RNA 引物引物→ → 转录激活转录激活→→ 前导链前导链 → → 复制叉复制叉→→ 滞后链滞后链多复制子多复制子真核生物真核生物 (500-5000bp/min) (500-5000bp/min) • DNA DNA复制的转录激活复制的转录激活 RNARNA聚合酶聚合酶 [ [ 利福平利福平 S S ] ]先导链先导链 10 bp  RNA引物引物  ori. dnaG滞后链引物酶滞后链引物酶 [ [ 利福平利福平 R R ] ]引发酶引发酶引发体引发体     滞后链滞后链DNA的合成的合成pppRNA引物引物DNA聚合酶聚合酶 IIIpppDNA polymerase IDNA聚合酶聚合酶 IDNA连接酶连接酶•  RNApol (RNA RNApol (RNA 聚合酶聚合酶) [ ) [ 利福平利福平 S S ] ]•  dnaG (dnaG (引发酶引发酶) [) [利福平利福平 R R ] ]                  完成对后随链引物的合成完成对后随链引物的合成                         •  完成完成±10bp RNA引物合成后，引物合成后，                       DNApolII 进行进行DNA链的延伸链的延伸  •  DNApol I 对对RNA引物切除并聚合填补引物切除并聚合填补   •  DNA连接酶将连接酶将冈崎冈崎片段、片段、dUMP dUMP 片段连接片段连接 完成对先导链引物的合成完成对先导链引物的合成 实现实现DNA复制的转录激活起始复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个冈崎片断较先导链的启动落后一个冈崎片断 总结：总结： 3.5.   DNA复制的酶及蛋白质复制的酶及蛋白质DNA复制时蛋白质的协同作用复制时蛋白质的协同作用Top I,   Top II 解旋酶解旋酶 单链结合蛋白单链结合蛋白 (SSB)螺旋去稳定蛋白螺旋去稳定蛋白 (HDP) DnaB 蛋白蛋白DnaC 蛋白蛋白 引发酶（引发酶（dnaG））Ungase DNA 聚合酶聚合酶 IIIDNA 聚合酶聚合酶 IDNA连接酶连接酶 引发体引发体复复制制体体进进 化化 中中 形形 成成 了了 灵灵 活活 的的 多多 酶酶 复复 合合 体体  1. 解旋酶解旋酶E.coli E.coli        C / 基因组基因组 = 4.2 × 106 bp          30-40s / 每次复制每次复制       10 bp / 每圈螺旋每圈螺旋             84000 -105bp / min 解旋解旋        ( 8400-10000 rpm   !   高速离心机高速离心机 )能量？能量？复制叉两侧复制叉两侧DNA双螺旋解旋的相关酶双螺旋解旋的相关酶DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶 I   DNA的的单链单链瞬间断裂瞬间断裂                      缓解缓解高速旋转，高速旋转，                     引入正向超螺旋，解出应力引入正向超螺旋，解出应力DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶 II   DNA的的双链双链瞬间断裂瞬间断裂                        缓解缓解高速解旋时，高速解旋时，DNA双链的相互缠绕双链的相互缠绕                       引入引入负超，负超，消除复制叉移动时产生的消除复制叉移动时产生的正超正超DNA 解旋酶解旋酶                       ATpase活性，解除活性，解除 1氢键氢键 ／水解／水解 2ATP解旋酶解旋酶单链结合蛋白单链结合蛋白引发体引发体引发酶引发酶DNA聚合酶聚合酶IIIRNA引物引物DNA聚合酶聚合酶I（引发酶和解旋酶）（引发酶和解旋酶）（（2）参与）参与DNA复制起始的酶复制起始的酶RNA聚合酶聚合酶            合成合成DNA前导链的前导链的RNA引物引物  引发酶引发酶                     合成合成DNA后随链的后随链的RNA引物引物（（dna G））                                        (冈崎片段冈崎片段) 单链结合蛋白单链结合蛋白         结合单链结合单链DNA（（SSB ））                  阻止阻止DNA复性复性                                 单单链结合蛋白（链结合蛋白（SSB））功能：功能：（（1））防止单链重新配对防止单链重新配对形成双链形成双链DNA；；（（2））防止被核酸酶降解防止被核酸酶降解；；（（3）） 为为DNA复制、重组和修复提供条件复制、重组和修复提供条件。

特点：特点：（（1）可以被）可以被重复使用重复使用；；（（2））不具备酶的活性不具备酶的活性，不和，不和ATP结合；结合；（（3）主要以）主要以四聚体四聚体形式发挥作用形式发挥作用DNA 聚合酶聚合酶 I                    103kd DNA 聚合酶聚合酶 II                   90-120kd （（3）参与）参与DNA复制延伸的酶复制延伸的酶DNA 聚合酶聚合酶 III                  130kd         包包含多个亚基含多个亚基原核生物原核生物DNA 连接酶连接酶                        75kd（连接（连接DNA链链3’-OH末端末端和另一和另一DNA链的链的5’-P末端末端，生，生成成磷酸二酯键磷酸二酯键，，消耗消耗ATP））  DNA聚合酶聚合酶 I、、II、、III比较（原核生物）比较（原核生物）• PolA                              PolB                            PolC I                                   II                                III • 5’→3’聚合酶活性聚合酶活性                   有有                                     有有        (dNMP)n + dNTP →(dNMP)n+1 +  ppi · 16-20 dNt/秒秒             2-5 dNt/秒秒              250-1000 dNt/秒秒 DNA DNA的修复、的修复、RNARNA引物切除引物切除 DNADNA修复修复 DNADNA复制复制• 3’→5’ 外切核酸酶活性外切核酸酶活性            有有                                    有有       (校对功能校对功能)• 5’→3’ 外切核酸酶活性外切核酸酶活性            无无                                     无无     （切除修复）（切除修复） • 持续合成持续合成DNA长度长度            3-200Nt                    10kNt                        500kNt•      酶活较弱酶活较弱                                 弱弱                              强（强（I*15, II*300）） DNA 聚合酶聚合酶α          合成引物合成引物DNA 聚合酶聚合酶β         不能持续合成不能持续合成DNA DNA 聚合酶聚合酶γ         合成线粒体合成线粒体DNA真核生物真核生物DNA 聚合酶聚合酶δ        持续合成持续合成DNA（需要（需要PCNA, *40））DNA 聚合酶聚合酶ε         持续合成持续合成DNA（（3）参与）参与DNA复制延伸的酶复制延伸的酶真核生物真核生物DNADNA复制的特点复制的特点●    多复制子多复制子原核生物原核生物.  105 bp/min       真核生物真核生物.   500-5000 bp/min                        13-900kb/复制复制 ● DNADNA聚合酶聚合酶α + α + 引发酶引发酶 (50-60kd) (50-60kd)  6-9 Nt  RNA引物引物 例：果蝇例：果蝇   5000 复制子复制子受精后受精后     基因组复制基因组复制/3min  ●    每个复制子在一个细胞周期中每个复制子在一个细胞周期中只启动一次只启动一次，启动时间并不一致，启动时间并不一致复制子复制子 扩增到扩增到50,000  （机制尚不清楚）（机制尚不清楚）后随链的回环模式后随链的回环模式引发体引发体解旋酶解旋酶RNA引物引物引物酶引物酶DNA聚合酶聚合酶III3.6.   DNA复制的过程复制的过程不同生物不同生物DNADNA复制的具体过程有所不同，复制的具体过程有所不同，但是，所有生物体的但是，所有生物体的DNADNA复制过程都包括复制过程都包括三个阶段：三个阶段： （（1 1）起始）起始 （（2 2）延伸）延伸 （（3 3）终止）终止3.6.1   DNA复制复制     的起始的起始1. 1. 原核生物原核生物DNADNA复制的起始复制的起始※ ※复制起点复制起点 E. E.colicoli的的orioriC C长度为长度为245bp245bp，由两类元件组成：，由两类元件组成： （（1 1））13bp13bp重复序列重复序列，，3 3次重复（次重复（1313聚体聚体）；）； （（2 2））9bp9bp重复序列重复序列，，4 4次重复。

次重复 （（9 9聚体聚体）） 与解旋酶结合启动与解旋酶结合启动DNADNA复制复制※ ※复制引发复制引发a. 形成形成初始复合体初始复合体；；    b. 形成形成开放复合体开放复合体；；c. 形成形成引发前复合体引发前复合体；；d. 形成形成引发体引发体2. 2. 真核生物真核生物DNADNA复制的起始复制的起始S40S40 DNADNA复制起始复制起始T T抗原抗原（具有解旋（具有解旋酶活性）与酶活性）与oriori结合结合后，促进后，促进DNADNA解链复制引物由宿主细复制引物由宿主细胞胞DNADNA聚合酶聚合酶α合合成酵母酵母 DNADNA复制起始复制起始复制起点识别复合复制起点识别复合物物具有具有ATPase活性，活性，该复合物识别并结该复合物识别并结合合自主复制序列自主复制序列，，与与细胞分裂周期蛋细胞分裂周期蛋白白6结合，激活其结合，激活其ATPase活性，促进活性，促进DNA复制进行复制进行自主复制序列自主复制序列3.5.  线状线状 DNA的复制的复制        及避免及避免5’末端短缩的模式末端短缩的模式 3’-OH ? 3‘-OH环形环形 DNA DNA 复制的后随链复制的后随链 线形线形DNA DNA 的后随链的后随链但是但是 3‘5‘5‘3‘3’-OH ? a)a)Watson J. D Watson J. D T T7 7 phage phage • Direct repeat in the end of linear DNA         • Concatermer between two offspring DNA after replication      共联体共联体(100 dNt terminal redundancy)??concatermer concatermer 3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH含含RNase切割位点切割位点RNaseIIIb)   Replication of linear Adnovirus-2 DNA 35937 bp pTP       C    G                                                        IR 103-162 IR ; including 50 bp replication originIR ; including 50 bp replication origin rich AT & 1 rich AT & 1thth C/G high conversation C/G high conversation pTP ; pre-Terminal proteinpTP ; pre-Terminal protein  80 kd →  TP 55 kdSSB ; S.S. DNA binding proteinSSB ; S.S. DNA binding protein 72 kd Ad2 DNA polymerase ;Ad2 DNA polymerase ; 140 kd  复制起始复合体复制起始复合体                       引发复制引发复制  （不需引物）（不需引物） 避免避免5’-end shorten pTp-Ser-dCMP CG● 过程过程                    SSB  +  ATP             DNA 末端解链末端解链  TP pTP-Ser  +  dCTP            pTP-Ser-dCMP 3‘ OHIRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplaced S.S DNA   Hairpin PanhandlepTP-Ser-dCMPG 3’G 3’G 3’TPc)   真核生物染色体真核生物染色体 DNA末端补齐模式末端补齐模式 ● 端粒的发现端粒的发现 •1938 Muller  X-ray                 Drosophila  末端极少发生缺失和倒位末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定构，使染色体趋于稳定.并定名为并定名为Telomere• 1938 B.McClintock       顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。

顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接       推测染色体末端具有特殊端粒结构推测染色体末端具有特殊端粒结构1970s 分子生物学发展 端粒研究获得突破pBR322PvuBg1ARSTELTELBam H1Bam H1四膜虫四膜虫rDNABg1PvuBam H1转化酵母转化酵母Pvu传代传代酵母酵母TEL？！？！ Shampay J. & Blackburn 加尾实验加尾实验 转化酵母转化酵母 传代传代酵母酵母TELPvu 酶切连接Pvu酵母酵母 DNAPvu酵母酵母TEL酵母酵母TEL？！？！            端粒的模板链在何处端粒的模板链在何处?端粒酶的发现为揭示端粒序端粒酶的发现为揭示端粒序列复制的模板及避免列复制的模板及避免5’端短端短缩的机制奠定了重要的基础缩的机制奠定了重要的基础             端粒的模板链在何处端粒的模板链在何处?加尾实验未能证明延伸端加尾实验未能证明延伸端粒序列的模板从何而来粒序列的模板从何而来● 端粒端粒DNA (Telomere)(Telomere) TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端序列高度重复的末端 5’   TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG   3’ (rich G chain) 3’   AACCCC AACCCC AACCCC 5’                  (rich C chain) ●   1985.  Carol Greider & Blackburn,          1986.  Gottchling Gottchling 尖毛虫尖毛虫 telomere binding proteintelomere binding protein –1  55kd  telomere binding protein telomere binding protein –2  26 kd四膜虫四膜虫  telomerasetelomerase游扑虫游扑虫  telomerasetelomerase+ 100 bp telomere 200－－500KDaRNA  CAAAACCCC  链链  + 具有具有逆转录酶活性的 末端结合蛋白末端结合蛋白(TBP））                                                                                      1990 Yu和和Blackburn  在体外加尾实验的反应体系中在体外加尾实验的反应体系中                加入这段加入这段RNA区域的区域的反义序列反义序列GTTTTGGGGTTG证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板 端粒酶的加尾功 能受到明显抑制1990 Yu和Blackburn 在体外加尾实验的反应体系中证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板 转化四膜虫后代的染色体端粒出现了突变序列的端粒对对CAACCCCAA序列进行诱变序列进行诱变 modelmodel TBP is Reverse transcriptase-like  端粒结合蛋白端粒结合蛋白 RNA complement with 3’ end of DNA           & as template  for cDNA Elongated T2G4 3’-end as primer for 5’-end DNA synthesis G链链 –T2G4-----TTGGGGT TGGG  C链链--A2C4---- telomerase 3’ aaaAACCCCAACuuac--- 5’ TTGG链链 –T2G4-----GGT TGGG  C链链--A2C4----TTG telomerase 3’ aaaAACCCCAACuuac--- 5’ GGGTTGG链链 –T2G4-----GGT TGGG  C链链--A2C4----TTGGGGTTG------------- telomerase 3’ CCAACCCCAACCCC--- 5’  telomerase 3’ CCAACCCCAACCCC--- 5’ When G-rich strand is  longer enough telomerase 3’ aaaAACCCCAACuuac--- 5’   G        G  hoogsteen bond   Tetraplex helix G链链 –T2G4-----TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG  C链链--A2C4----- G链链 –T2G4-----TTGGGG t t  g g g g t t gC链链--A2C4----- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polorTelomerase activityTelomerase activity is repressedis repressed in somatic cells of in somatic cells of multicelluar organisms multicelluar organisms resulting inresulting in a gradual a gradual shortening of the chromosome with each cell shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reachesgeneration. As this shortening reaches informational informational DNA,DNA, the cells senesce and die. the cells senesce and die. 细胞分裂细胞分裂    端粒阈值端粒阈值informational DNA细胞停止分裂或死亡细胞停止分裂或死亡When telomerase activity is repressed人体发育完成，端粒酶被抑制，人体发育完成，端粒酶被抑制， 细胞分裂次数与端粒长短呈反比细胞分裂次数与端粒长短呈反比细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值端粒长短端粒长短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重复片段为探针检测端粒的重复片段为探针检测     胎儿细胞株胎儿细胞株婴儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株青年细胞株老年细胞株老年细胞株年龄年龄小 大端粒长度端粒长度 长 短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老＞＞研究端粒研究端粒（记时器）（记时器）丢失的速率丢失的速率/ 年，预测人类的寿命年，预测人类的寿命 XX XY why?XX XY why?生殖细胞、癌细胞的繁殖生殖细胞、癌细胞的繁殖 ( (端粒酶的激活！细胞得以永生！端粒酶的激活！细胞得以永生！) )随着组织、细胞的老化随着组织、细胞的老化染色体端粒的长度变短染色体端粒的长度变短小麦不同细胞内小麦不同细胞内端粒长度的变化端粒长度的变化3.3 DNA复制的终止复制的终止E.coli (单起点双方向单起点双方向)两复制叉的相遇处具有多个终止位点两复制叉的相遇处具有多个终止位点(不是复制叉简单相遇）不是复制叉简单相遇）               terE, D, A     terF, C, B (22bp保守区保守区)F BTerminus Utilization Substance（（TUS 36kd）终止蛋白）终止蛋白CADETer-TUS复合体 terE, D, A  仅对反时针方向的复制叉具有终止效应仅对反时针方向的复制叉具有终止效应   terF, B, C  仅仅对对顺时针顺时针方向的复制叉具有终止效应方向的复制叉具有终止效应 F BCADETer-TUS复合体复合体         (Rep. fork trap)终止终止DnaB(螺旋酶螺旋酶)防止防止DNA过度复制过度复制避免出现避免出现DNA多聚体，高拷贝多聚体，高拷贝氨基酸饥饿状态，氨基酸饥饿状态，DNA复制起始失控复制起始失控         3.7.    DNA复制的调控复制的调控 • Repressor  model • Antisense RNA model • RNA-2 Positive control RNA-2 Positive control 0-555                                                     0 RNA-2 RnaseHOH RNA-2DNA / RNA primer for DNA replication e.g. ColEI plasmid (15-20)e.g. ColEI plasmid (15-20)Negative control转录起点转录起点复制起点复制起点RNA-1110 bp RNase H 不能识别不能识别D.S. RNA-1/RNA-2, 不能通过转录激活形成不能通过转录激活形成primer 的3’-OH -555 -4450RNA-2RNA-1RNA-2 110 bp D.S. RNARNA-1                               0  When RNA-2200-360Nt RNA-1 / RNA-2  不能形成不能形成primer的的 3’-OH 促进促进 限限制制 63 aa ROP63 aa ROP(Rom protein)(Rom protein) RNA-2   只能转录只能转录100-220 base,                不能到达不能到达“0”原点原点 不能形成不能形成primer 的的3’-OH0RNA-RNA-1 1位于复制叉处的多酶复合体（复制体）位于复制叉处的多酶复合体（复制体）完成完成 后随链后随链 DNA延伸时延伸时• 必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段• 后随链多酶系统后随链多酶系统                 必须完成多次反复的启动与扩展必须完成多次反复的启动与扩展                 E.coli   启动启动2000—4000次次的冈崎片段复制的冈崎片段复制。