蜡组织芯片制备技术的改良.doc

1蜡组织芯片制备技术的改良【摘要】 目的:探讨组织芯片制备方法以及相关技术改良，提高组织芯片制备的质量方法:使用组织芯片空心蜡模一次性成型的模具，应用改良的组织芯片制备方法以及二次石蜡包埋技术，制作食管癌肿瘤组织芯片，常规病理石蜡切片制备组织芯片，观察实验结果结果:组织芯片空心蜡模制备成功率达 100%所制备的组织芯片石蜡块内组织芯切片平面整齐，无组织芯倒浮现象组织芯片切片中组织芯片微组织片阵列整齐，无微组织片皱褶以及微组织片脱片现象组织芯片常规HE 染色后，经病理诊断医生阅片，并与各组织芯原供体石蜡标本常规病理 HE 染色片进行对照观察，病理诊断结果一致结论:改良的石蜡组织芯片制备技术简单易学，操作流程容易掌握控制，提高了组织芯片制作的质量，有利于组织芯片技术的普及和推广应用 【关键词】 组织芯片 技术改良 食管癌组织芯片技术是继基因芯片、蛋白质芯片后又一重要的生物芯片技术平台，它是将数十个甚至数千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列[1]组织芯片作为一种高通量、大样本以及快速的生物分子水平研究分析工具，克服了传统病理学方法和基因芯片技术中存在的某些缺陷，在医学分子生物学研究领域发挥了愈来愈重要的作用，对于疾病的分子诊断，预后指标和治疗靶点的定位、抗体和药物筛选等均有十分重要的实用价值，是疾病研究从基础研究走向临床应用研究重要的桥梁[2-6]。

本研究针对现有组织芯片制备过程中存在的一些不足，如组织芯片空心蜡模制备操作程序较为繁琐以及组织芯片石蜡块二次包埋质量欠佳等，研究探索出一种行之有效的组织芯片制备方法，有利于组织芯2片技术在医学临床、病理学等研究领域的进一步推广应用1 材料和方法1.1 材料 收集温州医学院附属台州医院 2004 年 9 月至 2007 年 2 月间手术离体食管癌组织标本 30 例对组织标本手术切缘至癌灶部全程黏膜组织以及癌灶组织进行取材，分段处理所有标本均经过 10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片以及组织病理学检查证实每例食管癌组织标本均包含有：癌组织、不典型增生以及正常食管黏膜组织石蜡切片机（leica RM 2135）、一次性石蜡切片刀片均购自德国徕卡公司组织芯片制备系统（HT-1）购自朝阳恒泰科技发展有限责任公司1.2 制作组织芯片空心蜡模 利用组织芯片空心蜡模成型模具，一次成型制作组织芯片空心蜡模，具体操作如下：①将石蜡放入组织芯片制备系统熔蜡盘内加热熔化，熔蜡盘内放入一片适当大小的硬质光面塑料薄板将空心蜡模成型框大口朝下平放于熔蜡盘中的塑料薄板上，调整熔蜡盘内石蜡的量，使熔化石蜡平面高出空心蜡模成型框约 2 mm。

②将无刃阵列管针管口朝下放置于组织芯片制备系统加热板上预热（70 ℃）约 10 min，平稳垂直插入上述空心蜡模成型框③平稳移开熔蜡盘，室温冷却石蜡数分钟，熔蜡盘中石蜡呈半凝状态时，下压空心蜡模成型框活动顶板，使其贴近蜡模成型框④用小刀将空心蜡模成型框四周石蜡划离，继续室温冷却石蜡数分钟，熔蜡盘中不再有任何能流动的液体状石蜡⑤将熔蜡盘放回组织芯片制备仪上加温数秒钟，熔蜡盘底部石蜡开始熔化时迅速整体移除阵列管针、蜡模成型框、蜡模成型框内的蜡模⑥插入阵列管针针芯，推出并去除进入阵列管针内的石蜡，拔除阵列管针针芯，去除蜡模成型框外部残留的石蜡⑦使用组织芯片空心蜡模拔模装置，均匀拔除阵列管针，去除蜡模成型框活动顶3板以及蜡模成型框周边残留的石蜡组织芯片空心蜡模制备完毕（见图 1）组织芯片空心蜡模无需从蜡模成型框中取出1.3 制作组织芯片石蜡块 ①目标组织定位：组织芯片供体蜡块常规病理切片 1张，片厚 4μm，常规 HE 染色后进行组织病理诊断阅片，在组织切片的指引下，对相应供体蜡块进行目标组织定位标记②组织芯片蜡芯取材与点样：将蜡块放入适当温度的热水中预热软化片刻，应用组织芯片制备系统的芯片石蜡组织芯取样器钻取目标组织柱。

目标组织柱逐一点样于组织芯片空心蜡模中指定的位置用实心单针逐一将目标组织柱轻轻压平，使其处于同一切片平面将装满组织芯的蜡模平行移至一块薄铜板上，加热铜板数秒至贴近铜板的蜡模稍加熔化，迅速移除铜板，室温冷却数秒后去除铜板③二次包埋组织芯片石蜡块：芯片组织面朝下，将点好样的组织芯片蜡块连同蜡模成型框放入盛有少量熔化石蜡的熔蜡盘中（熔化石蜡的深度约 4 mm），数秒种后即可肉眼观察到熔化的石蜡浸入到石蜡组织芯与蜡模孔的间隙移除熔蜡盘，将塑料石蜡包埋盒放于蜡模成型框上，用小勺舀取熔化的石蜡倒入包埋盒中，室温冷却数分钟，石蜡半凝状态时用小刀划离蜡模成型框周围的石蜡石蜡完全凝固后，复加热熔蜡盘移除二次包埋好的组织芯片石蜡块④去除蜡模成型框以及塑料石蜡包埋盒周边残留石蜡，轮流加热蜡模成型框四周边框，使紧贴其边框内侧的石蜡熔化，取出成型的组织芯片石蜡块（见图 1E）1.4 组织芯片切片制作及其应用 应用常规病理切片技术制作组织芯片石蜡切片，根据不同的研究目的，将组织芯片石蜡切片铺于净洁的或经过其他特殊处理的载玻片上（见图 2），继续应用于常规 HE 染色、免疫组织化学染色以及原位杂交等细胞学或分子生物学检测。

42 结果2.1 组织芯片石蜡块 所制备的组织芯片空心蜡模内无空泡，无裂痕，阵列孔均一整齐，无变形，空心蜡模制备过程中无废模出现，蜡模制备成功率达 100%所制备的组织芯片石蜡块内组织芯切片平面整齐，无组织芯倒浮现象2.2 组织芯片 组织芯片肉眼观察：石蜡切片中组织芯片微组织片阵列整齐，无微组织片皱褶以及微组织片脱片现象组织芯片光学显微镜观察：组织芯片常规 HE染色后，经病理诊断医生阅片，并与各组织芯原供体石蜡标本常规病理 HE 染色片进行对照观察，病理诊断结果一致表明所制作的组织芯片取材的准确性高，能满足进一步的实验研究需要3 讨论1986 年 Battifora[7]首先在 Lab Invest 发表文章，创立了组织芯片的雏形1998年，Kononen 等[1]首先提出了组织芯片（Tissue microarrays）的概念，即将数十个甚至数千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上形成组织微阵列生物芯片，此项研究突破了单一的肿瘤基因芯片表达谱研究模式，开始结合细胞和组织水平的高通量技术医学分子生物学研究领域于是有了一种新的高通量、大样本的快速分析工具组织芯片将众多样本放在同一切片上，同化了实验条件，减少了因普通实验方法中分批、分次实验造成的实验误差，节约了实验试剂和时间。

根据不同的需要可设计单一肿瘤组织芯片、多肿瘤组织芯片、肿瘤进展组织芯片、肿瘤预后组织芯片等等不同类型的组织芯片[8]组织芯片结合传统病理学技术、免疫组织化学以及原位杂交等分子生物学技术[9，10]，广泛地运用于生命科学研究领域，5为基因功能研究走向临床提供了捷径组织芯片技术有省时、省力、低成本、高通量、大样本等许多优点，但实际制作组织芯片的过程中仍有许多有待改进之处，为此，研究者对组织芯片制备技术进行了不懈的探索和研究本研究针对组织芯片制作过程中存在的缺陷，自行研制了组织芯片空心蜡模一次性成型模具，并对组织芯片制作技术进行改良，取得了良好的效果关于石蜡的选择石蜡黏稠度高、韧性强，常规打孔时不易断裂，但拔除组织芯片阵列管针时阻力大，阵列管针不易拔除反之，则容易将实心空白蜡模打裂，产生废模[11，12]应用组织芯片空心蜡模一次性成型模具制备空心蜡模，无需先制备组织芯片实心空白蜡模再进行打孔处理，有效避免了上述因蜡模打孔操作引起的系列问题，使用不同熔点不同黏稠度的石蜡，均可顺利制备完好的空心蜡模，成品合格率达 100%关于二次石蜡包埋组织芯片石蜡块二次包埋成功与否，直接影响到组织芯片的质量二次包埋成功的组织芯片石蜡块，应具备如下特点：组织芯片蜡块中，石蜡组织芯排列整齐，无移位现象；石蜡组织芯处于同一切片平面，无石蜡组织芯倒浮现象；石蜡组织芯与空心蜡模融合良好，二者间不留有空隙，保证所制作的组织芯片中的微组织块无皱褶以及脱片现象。

采用普通灌注熔化石蜡的方法进行二次包埋[13]，熔化的石蜡很难有效灌注到石蜡组织芯与空心蜡模孔壁间的微小间隙，主要是因为熔化的石蜡接触到处于室温的蜡模时，往往未进入到石蜡组织芯与空心蜡模孔壁间的微小间隙就已开始凝固，致使二次石蜡包埋有名无实将熔化石蜡的温度调高到足以能顺利进入石蜡组织芯与空心蜡模孔壁间的微小间隙的温度，则熔化的石蜡即会将组织芯片石蜡块整体熔化，致使组织芯片石蜡块毁损于是6研究者研制出组织芯片二次包埋仪[14]，采用熔化石蜡灌注同时进行负压抽吸的方法进行二次石蜡包埋当石蜡组织芯与空心蜡模间的间隙较大时，适当调整熔化石蜡的温度和负压压力，采用该方法能取得较好的二次包埋效果；而当石蜡组织芯与空心蜡模间的间隙较小时，负压吸引的作用极其有限，难以获得良好的二次包埋效果另有研究者建议将装满石蜡组织芯的组织芯片石蜡块整体放入烤箱中逐渐缓慢升温处理，使石蜡组织芯与组织芯片蜡模融合，达到二次包埋的目的[11,13,15]其不足之处是温度和时间较难控制，费时、费力，二次包埋效果亦不尽人意本研究将装满石蜡组织芯的组织芯片石蜡块整体放入维持加温的少量熔化石蜡中，直接将石蜡组织芯与组织芯片蜡模进行融合处理，取得了满意的效果，而且实际操作过程简单，容易掌握控制。

需要引起注意的是组织柱点样完毕，一定要将组织柱逐一轻轻压下，使其处于同一切片平面；二次石蜡包埋前，一定要进行简单的组织柱防脱处理，以免在将装满石蜡组织芯的组织芯片石蜡块整体转入熔蜡盘中时，部分组织柱脱落二次石蜡包埋时，同时将组织芯片石蜡块与塑料包埋盒一同固定，有利于组织芯片蜡块标记，并有利于常规石蜡切片时能将组织芯片石蜡块直接固定到石蜡切片机上，便于切片总之，本改良的石蜡组织芯片制备技术无需应用负压吸引等特殊仪器设备，技术简单易学，操作流程容易掌握控制，有利于组织芯片技术的普及和推广应用参考文献】[1] Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for high- throughput molecular profiling of tumor specimens[J]. Nature Med, 1998, 4(7): 844- 847.[2] Simon R, Mirlacher M, Sauter G. Tissue microarrys[J]. Biotechniques, 2004, 36(1): 98-105.7[3] Simon R, Mirlacher M, Sauter G. Tissue microarrays in can-cer diagnosis[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2003, 3(4): 421-430.[4] Bubendorf L. High throughput microarray technologies: from genomics to clinics[J]. Eur Urol, 2001, 40(2): 231-238.[5] Rubin MA, Dunn R, Strawderman M, et al. Tissue microarray sampling strategy for prostate cancer biomarker analysis [J]. Am J Surg Pathol, 2002, 26(3): 312-319.[6] El-Mansi MT, Williams AR. Evaluation of PTEN expres-sion in cervical adenocarcinoma by tissue microarray[J]. Int J Gynecol Cancer, 2006, 16(3): 1254- 1260.[7] Battifora H. The multitumor ( sau。