【最新word论文】Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表达【临床医学专业论文】.doc

1Megalin 基因片段（3189-4169）的克隆及其表达【关键词】 肾炎【摘要】 目的 大鼠 Heymann 肾炎（HN）是人类膜性肾病的经典动物模型，其发病机制的研究推动了人们对膜性肾病的理解Megalin 是 HN 主要致病抗原，也是低密度脂蛋白受体家族成员，其胞外结构形成的 4 簇配体结合区域均可能存在抗原决定簇本实验拟克隆其第 2 簇配体结合区域，并表达融合蛋白，为进一步研究其抗原决定簇的确切位置及其功能打下基础方法 采用 RT-PCR 获得大鼠肾目的片段 Megalin 基因 3189-4169，再与原核表达质粒 pTrcHis A 结合构建重组质粒，然后将重组质粒转入 TOP10 细菌诱导表达融合蛋白，最后用 Western-Blot 检测表达的融合蛋白结果 （1）RT-PCR 获得的目的片段大小为 1kb，测序证实为 Megalin 基因 3189-4169;测序报告还显示有 3 个突变，分别位于Megalin 基因的 3404、3647、3702，其中前两个突变都不影响融合蛋白的氨基酸序列，第 3 个突变则将赖氨酸变成谷氨酸，经分析对融合蛋白表达无明显影响2）构建的重组质粒用 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶切后，得到预期的 2 个片段 4.4kb和 1kb，分别表示质粒 pTrcHis A 和 Megalin 基因 3189-4169。

（3）用 IPTG 诱导TOP10（含有重组质粒）融合蛋白表达后，经 Western-Blot 检测发现了 38kD 的目的蛋白阳性对照 TOP/CAT 在 IPTG 诱导前没有出现蛋白条带，在 IPTG 诱导后4h 出现蛋白条带；阴性对照 TOP10（不含有质粒）和 TOP10（含有 pTrcHis A）经 IPTG 诱导后均无目的条带出现另外，融合蛋白的表达量在 IPTG 诱导后4~6h 增加明显结论 成功构建了重组表达质粒（带有 Megalin 基因 3189-4169的 pTrcHis A） ；成功诱导了融合蛋白的表达，为进一步研究 Megalin 基因抗原决定簇的确切位置及研究 Megalin 的功能提供了基础关键词】 肾炎;基因;表位;融合蛋白【Abstract】 Objective Rat Heymann nephritis（HN）is a classic model of human membranous nephropathy.Research of its pathogenesis help understand the human membranous nephropathy.Megalin is the major antigen of HN,and it is also a member of the low density lipoprotein receptor gene family；its extracellular region can bind multiple ligands,and this extracellular region form four clusters of ligand-binding domains containing pathogenic epitopes.So we cloned the second cluster of ligand binding repeats and express the recombinant proteins containing N-Terminal 6xHis tags.This study was aimed to provide the basis to precisely locate the pathogenic epitope and help understand its function.Methods We applied reverse transcription PCR to obtain objective band（Megalin gene 3189-4169）,then constructed the recombinant plasmid by inserting this fragment into pTrcHis A.After the recombinant plasmid was transfected into TOP10,the expression of 6xHis fusion protein was induced by isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）.Finally Western-Blot was performed to detect the 2fusion protein.Results RT-PCR showed the size of object band wss 1kb.After recombinant plasmid were digested with BamHⅠand EcoRⅠ,we obtained two fragments:one size was 1kb,the other was 4.4kb.Western-Blot showed the fusion protein size was 38kD，and the yield of fusion protein was obviously increased at 4~6 hours by IPTG inducing.Conclusion We succeed in constructing recombinant plasmid and obtaining the fusion protein,which may provide basis for further study.【Key words】 nephritis;gene;epitope;fusion protein膜性肾病是儿童及成人常见难治性肾脏疾病之一，以上皮下免疫复合物的沉积致肾小球基底膜增厚和蛋白尿为特征；其发病机制尚不清楚，现有对膜性肾病的认识很多来自于其经典动物模型 Heymann 肾炎（HN）的研究。

因此，对Heymann 肾炎的分子免疫病理机制的研究将有助于提高对膜性肾病的认识，从而改进治疗现已明确 Megalin（也称 gp 330）是 HN 的主要致病抗原成分，在肾脏主要表达于近端小管的刷状缘和肾小球上皮细胞的胞被小凹中［1,2］ 它是一个跨膜糖蛋白，属于低密度脂蛋白受体家族成员，胞外区形成 4 簇潜在的受体配体结合区域［3］ ；可与多种配体结合，包括受体相关蛋白（RAP） 、血纤维蛋白溶酶原、细胞外基质成分、纤溶酶原激活因子和纤溶酶原激活因子抑制物Ⅰ型复合物、载脂蛋白 E 富集的 β-VLDL、脂蛋白脂肪酶、乳铁转移蛋白以及钙离子、胰岛素等［4~7］ 对 Heymann 肾炎中 Megalin 可能与 RAP 结合形成 HN 抗原复合物，再与循环中的抗体结合形成原位免疫复合物，导致肾小球的损伤和继之的大量蛋白尿［4,8］ 对 Heymann 肾炎抗原的研究认为 Megalin 和 RAP 上均存在抗原决定簇RAP上的抗原决定簇定位在 N 末端的 15 个氨基酸（39-44 氨基酸） ［9,10］ ；国内研究认为 RAP C 末端的 108 个氨基酸多肽也可能存在 Heymann 肾炎病理性表型,而对 Megalin 的抗原位点的分析因其分子量大，目前尚不清楚。

Akihiko Saito 等研究发现 4 簇配体结合重复序列表达蛋白中，仅第 2 个配体结合区域表达的蛋白能被检测到；确定第 2 簇配体结合区域中的 46 个氨基酸（氨基酸 1160-1205，也是第 5 个配体结合重复序列）包含主要的抗原决定簇［11］ ，第 2 簇配体结合区域包含的结合位点，可与 RAP 及其他配体结合，而其他 3 簇配体结合区域则未见参与［6］ Andrew V.Oleinikov 等研究发现 Megalin N 末端一个 60kD 的片段（它定位在 Megalin 基因的第 1 簇配体结合区和第 1 个 YWTD 分隔区域,可能部分或者全部包含在 Megalin 的 180-453 氨基酸残基中）可以和 Megalin 完整的分子一样诱导完全的主动型 HN，因此他们认为这个片段包含有 T 和 B 抗原决定簇,这个观点与前面的研究不一致［12］ 故明确 Megalin 的确切抗原决定簇将有助于对 HN 肾炎分子机制的探讨，并最终有助于人类膜性肾病的治疗1 Megalin 基因片段（3189-4169）的获得1.1 材料与试剂 清洁级 SD 健康成年大鼠（来源于华中科技大学同济医学院3实验动物中心） 、Trizon 试剂（Omega Blotek 公司的 RNA-Solv Reagent） 、氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC 处理水、手术器械、玻璃匀浆器、Pharmacia Biotech 的Gene Quent RNA/DNA Calculator；逆转录酶 M-MLV（MBI 公司） 、Rnasin Ribonuclease Inhibitor（华美生物工程公司） 、dNTP（25mM 混） ； Roche 公司的 Expand Long Template PCR System、PCR 仪（PERKIN ELMER 公司的 GeneAmp PCR System 9600） 。

电泳槽、100bpDNA Ladder、lambdaDNA/HindⅢ+ EcoRⅠ Markers、英国 UVP 公司 GOS800 型凝胶成像分析系统实验引物由上海生工生物工程公司合成P1： “5′-CGT GGA TCC CAG CAG TGT GGC TCC CTC TC -3′” ；5′端有 BamHⅠ酶切位点 G↓GA TCC，酶切位点后的碱基序列开始于 Megalin 的3189（Megalin 基因序列查自 NCBI 的 GeneBank） P2： “5′-GCC GGA ATT CGC AAA GTG GGG ACT CGT CAG -3′” ；5′端有 EcoRⅠ 酶切位点 G↓AA TTC凝胶DNA 回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒（Omega 公司） 、BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ（TaKaRa 公司） 、T4 DNA Ligase（TaKaRa 公司） 、Lambda DNA/HindⅢ＋EcoRⅠ Markers、原核表达质粒 pTrcHis A（Invitrogen 公司） 、TOP 10 菌种（pTrcHis A 自带） 一抗 6-Histidine（Epitope Tagging）Ab-1（Clone 4D11）鼠单抗（NeoMarkers 公司） 、二抗为碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG（H+L） （北京中山生物技术有限公司） 、NBT/BCIP 染色试剂盒（华美生物工程公司） 、低分子量标准蛋白质（武汉天源公司） 、醋酸纤维膜、电泳仪（BioRad） 、电转仪（Biometra） 。

1.2 实验方法1.2.1 大鼠肾皮质总 RNA 提取 SD 大鼠开腹后，生理盐水灌洗肾脏，剪下肾皮质，留下 100mg 左右的样品；放入事先干烤过的玻璃匀浆器中，加入 1ml Trizon 试剂，按试剂说明书提取总 RNA，最后测 OD 值，并计算其浓度，OD260在 1.6~2.0 示其纯度高；将 RNA 于-70℃保存1.2.2 逆转录 总反应体系 20μl ；加入 5μg RNA，依次加入引物 P2、无RNase 水、M-MLV 5×buffer、dNTP、RNAsin、M-MLV，42℃温育 60min 后，95℃ 5min 终止反应，反应产物-20℃保存1.2.3 PCR 按 Roche 公司的 Expand Long Template PCR System 说明。