抗体的表达原理课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 抗体的表达,华南农业大学食品学院,廖振林,第七章 抗体的表达华南农业大学食品学院,提要,基因工程抗体巴在多种体系获得成功表达，包括哺乳动物细胞、大肠杆茵、酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物以及转基出动物等表达体系其中哺乳动物细胞最接近抗体产生的天然宿主，是比较成熟、应用最多的表达体系，主要用于表达完整抗体分子，目前治疗性单抗的生产基本都用这一表达体系通过对友达载体、宿主细胞及各环节的改良和完善，己可达到,100mg,L,左右的表达水平，大肠杆菌体系不能对表达产物进行糖基化，只能表达抗体分子片段，但由于其遗传背景清楚，操作简单，成本低，周期短等优点，亦有较广泛的应用，尤其在研究领域提要 基因工程抗体巴在多种体系获得成功表达，包,酵母细胞和昆虫细胞表达体系具有一定的糖基化功能，能表达完整抗体分子，可达到较高表达量，其操作及成本较哺乳动物细脑有一定优势，但在抗体表达中的应用尚不多，应用价值有待评价转基因植物和转基因动物表达体系主要用于工程抗体的大规模生产，其成功应用尚需时日酵母细胞和昆虫细胞表达体系具有一定的糖基化功,抗体载体体统的种类,1,哺乳动物表达载体系统,2,大肠杆菌表达系统,3,酵母及昆虫细胞表达系统,4,动植物表达系统,抗体载体体统的种类1 哺乳动物表达载体系统,第一节 哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞是最早用来表达抗体分子的，也是目前应用最多的表达体系。

哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确立体空间构象所必需的分子伴侣，其内质网为抗体分子的正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化,-,还原环境第一节 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞是最早用,此外哺乳类动物细胞还拥有完整的转录、翻译后加工及分泌等机制，包括抗体的糖基化、羧基化等一系列复杂的加工过程，因而哺乳动物细胞表达系统表达的抗体通常具有正确的折叠和空间构象以及正确的装配，具有良好生物活性，基本近似于天然抗体此外哺乳类动物细胞还拥有完整的转录、翻译后加工及分泌等机制，,同时哺乳动物细胞还能实现抗体的分泌性表达，表达产物可分泌至无血清或无蛋白的培养上清中，为抗体的分离纯化提供了最大的便利此外表达抗体的哺乳动物细胞也能进行规模化培养，为抗体的产业化相应用奠定了基础同时哺乳动物细胞还能实现抗体的分泌性表达，表,哺乳动物表达细胞,但哺乳动物细胞表达体系存在构建周期长、操作烦琐，表达产量相对低，生产成本较高等缺点因此、尽管哺乳功物细胞表达体系能用于各种基因工程抗体的表达但最适合表达的还是全分子抗体以及某些不适宜在非哺乳动物细胞表达的小分子抗体哺乳动物细胞表达体系包括宿主细胞和表达载体：目前常用的宿主细胞主要有两类，一类是淋巴类细胞，另一类是非淋巴类细胞。

哺乳动物表达细胞 但哺乳动物细胞表达体系存在构建,一、淋巴类细胞,在体内抗体是由浆细胞分泌产生的，浆细胞具有抗体正确折叠，空间构象形成，链内及链间二硫键形成的内环境，包括内质网及参与此过程的各种协向因子和分子伴侣,(,加重链结合蛋白,BiP GRP78,，二硫化异构酶等等,),，而且还合完成抗体恒定区糖基化等翻译后加工修饰的细胞器、蛋白及代谢产物；因此浆细胞应是最适合表达重组抗体的但浆细胞不能在体外长期培养，永生化或恶性转化的浆细胞瘤和骨髓瘤细胞系对于表达重组抗体是最接近浆细胞的，这些细胞同浆细胞一样能提供抗体表达所需的全套协同因子、分子伴侣以及糖基化等加工机制一、淋巴类细胞 在体内抗体是由浆细胞,因此能用于表达各种重组的基因工程抗体但是有的骨髓瘤细胞系本身也产生免疫球蛋白链，大多为,轻链，选择时应首先考虑用那些本身不产生免疫球蛋白肽链的骨髓瘤细胞系由于目前尚无稳定但自身不分泌,Ig,的人骨髓瘤细胞系，因此，用于表达基因工程抗体的淋巴类细胞，主要是小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞因此能用于表达各种重组的基因工程抗体但是有的,目前在表达基因工程抗体最多的骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞系,SP2/0,和,NSO,，以及大鼠的骨髓瘤细胞,YB2/0,。

这些骨髓瘤细胞均不产生和分泌任何免疫球蛋白SP2/0,细胞系是小鼠骨髓细胞,p3x63Ag8,与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞融合而成的杂交瘤，再经培养和药物筛选发生变异后获得的细胞系SP2/0,是在表达基因工程抗体中用得最广泛的淋巴类细胞，尤其在人,鼠嵌合抗体的表达中用得最多，仅其表达产量通常较低，多用于实验研究目前在表达基因工程抗体最多的骨髓瘤细胞是小鼠,NSO,细胞系是能在胞内合成,轻链的,NS1,细胞的变异株，不再产生任何免疫球蛋白链，能用于表达各种全分子抗体，用该细胞系表达的抗人,EGF,受体的人源化改型抗体己在三期临床试用中此外，也有用小鼠骨髓瘤,P3UI,细胞表达人,鼠嵌合抗体用于表达重组抗体的大鼠骨髓瘤细胞仅见有,YB2/0,细胞的报道，该细胞系是大鼠骨髓瘤细胞,Y3,与,A0,株大鼠脾细胞融合建立的，本身也不表达任何免疫球蛋白肽链用骨髓瘤表达重组抗体时，所用的表达载体通常多选用免疫球蛋白的启动子和增强子，因这些细胞中含有它们所需要的转录因子，有利抗体的高表达NSO细胞系是能在胞内合成轻链的NS1细胞的变异株，不再,二、非淋巴类细胞,多种非淋巴类细胞都已被用于表达重组抗体，其中包括中国仓鼠卵巢,(Chinese hamster ovary,，,CHO),细胞、猴肾来源的,COS,细胞、神经胶质瘤细胞、嗜伤细胞、,Hela,细胞、,BHK,细胞等等这些不同组织来源的不同类型的细胞，在蛋白质的糖基化中可能会有所差别，但到目前为止，尚未发现从这些非淋巴类细胞中表达的重组抗体有功能性的缺陷。

非淋巴类细胞在表达重组抗体时若使用免疫球蛋自自身的转录调控元件，如启动子、增强子等，其表达效率低、出此常采用其他较强的启动子，如,SV40,早期基因和晚期基因启动子,(P,sv40-EL,),二、非淋巴类细胞 多种非淋巴类细胞都已被用于表达重,CHO,人巨细胞病毒立早基因启动子,(P,hCMV-IE,),，病毒长末端重复序列,LTR,等等通常非淋巴细胞表达重组抗体的产量低于淋巴类细胞，大多数在,lug,ml,以下但近十余年的研究表明，通过一系列现代分子生物学技术，尤其是高效扩增表达技术，可使重组抗体在,CHO,细胞中的表达产量达,200ug/ml,CHO 人巨细胞病毒立早基因启动子(PhCMV,此外，,CHO,细胞遗传背景清楚；转染效率高；能适用于多种载体；能表达各种类型的重组抗体；可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体；可用无血清或无蛋白培养基培养，有利于抗体的纯化；能进行大规模培养因而,CHO,细胞已成为生物技术产业化培养的首选工程细胞系，目前已批准上市的基因工程抗体几乎都是在,CHO,细胞中表达的此外，CHO细胞遗传背景清楚；转染效率高；能,COS,另一种常用于表达重组抗体的非淋巴类细胞是,COS,细胞，,COS,细胞是用,sv40,病毒的大,T,抗原转染猴肾细胞获得的一株能长期传代的细胞系，含有,SV40,复制子的重组表达质粒转染,COS,细胞后，其重组,DNA,并不整合到细胞的染色体上、而是以游离的形式存在于细胞浆内、并迅速大量复制达到很高的拷贝数；,COS,细胞也具有糖基化和装,P,配分泌抗体的功能。

COS 另一种常用于表达重组抗体的非淋巴类细胞,因此表达的各种抗体具有抗体的功能活性：由于转染的外源,DNA,在,COS,细胞并不整合，而是以游离形式存在并复制，因此,COS,细胞最常用于抗体的瞬时表达近年来,COS,细胞己用于筛选或检测新构建的新型抗体的活性及特征，也用于研究从噬菌体库中筛选的抗体基因在真核细胞中表达的功能和特点，还用于各种抗体突变体的筛选而且，结构更为复杂的双特异性抗体也在,COS,细胞表达成功如抗人,OKT3/,转铁蛋白受体的双特异抗体在,COS,细胞成功表达，其产量和活性均优于在大肠杆菌中的表达因此表达的各种抗体具有抗体的功能活性：由于转染,三、抗体的高效表达,治疗用基因工程抗体的临床用药量大，还远超过其它生物制品以美国批准上市的治疗肿瘤的两种人源化抗体,Rituxan,和,Herceptin,为例 ，,Rituxan,一个疗程约需用药,1.2g,，,Herceptin,一个疗程约需用药,0.88g,，而正在临床试用的抗,VEGF,人源化抗体，一个病人的最大用药量甚至达到了,7.8g,，这些抗体类生物制品比细胞因子类生物制品用药量高出几万倍因而基因工程抗体的高效表达已经成为其临床应用的最重要的先决条件之一，甚至已影响到基因工程抗体的研究开发。

目前已上市的以及正处于临床试用中的基因工程抗体多达上百种，其中绝大多数那是在哺乳动物细胞中表达的，更确切地说，是在,CHO,细胞中表达的以下将简要地叙述抗体在哺乳动物细胞高效表达所涉及的诸多要素,(,见表,7-1),三、抗体的高效表达 治疗用基因工程抗体的临床,抗体的表达原理课件,抗体表达的策略,抗体在哺乳动物细胞中表达的过程是抗体的重组表达载体与宿主细胞之间相互作用的一个复杂过程，包括,5,个相对独立的环节：,抗体基因在宿主细胞染色体上的定位，主要是指抗体基因在染色体上的整合位点以及抗体基因的基因剂量抗体,mRNA,的转录，转录效率与,mRNA,的稳定性是其中最重要的因素抗体基因的翻译抗体的翻译后加工、组装抗体的分泌；针对以上,5,个环节，设计相应的措施提高各环节的效率，有助于提高基因工程抗体在哺乳动物细胞中的表达水平此外还有一些实际操作因素的影响，如高表达细胞株的筛选，生产细胞的稳定等等抗体表达的策略 抗体在哺乳动物细胞中表达的过程是,（一）哺乳动物细胞表达抗体的载体系统,基因工程抗体的表达载体系统是获得高表达抗体细胞株的关键，在确定宿主细胞后，基,因工程抗体的表达产量很大程度上由共表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。

一般来说，表达载体含有以下几种基本元件：骨架序列、选择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列除骨架序列外，其它元件对抗体的高效表达均存在一定的影响一）哺乳动物细胞表达抗体的载体系统 基因工程抗,载体系统分类,根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数能否扩增，表达载体可分为两类：,A,可扩增表达载体系统B,不可扩增表达的载体系统有一类特殊的选择标志基因可以在外界逐渐增高的选择压力下实现在宿主细胞染色体上的基因拷贝数的扩增，并且可以连带两侧的序列一同扩增，从而提高产量载体系统分类根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数能否扩增，表达载,二氢叶酸还原酶,(DHFR),目前报道的基因工程抗体的高效表达载体系统无一例外地采用了可扩增表达的载体上述的可扩增选择标志基因目前主要包括有二氢叶酸还原酶,(dhfr),基因和谷氨酰胺合成酶,(GS),基因，其中使用最久、最广泛、效果最好的,dhfr,基因dhfr,基因编码的,DHFR,是细胞代谢途径中的一个重要的酶当细胞缺乏此酶或此酶失活,时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核核苷才能存活二氢叶酸还原酶(DHFR)目前报道的基因工程,甲氨蝶呤,(MTX),是,DHFR,的类似底物可竞争抑制,DHFR,的活性。

当环境存在高浓度的,MTX,，,dhfr,基因可自发在染色体上扩增共拷贝数，以产生更多的,DHFR,来维持细胞的正常代谢，当其扩增时，可以连带它两侧的序列一起扩增，,dhfr,基因共扩增的序列的大小通常比该基因要大许多，甚至可以达到上千个,kb,，足以包含其两翼的目的抗体基因，这种共扩增也就实现了目的抗体基因的基因剂量的扩增，从而极大地提高表达产量甲氨蝶呤(MTX)是 DHFR的类似底物可,dhfr,基因在,CHO,细胞中扩增时能在染色体上形成较稳定的多拷贝序列，存在于宿主细胞染色体中因此选择可扩增表达系统时最好选择在,CHO,细胞中表达，另外内源性,dhfr,基因的存在会降低外源性,dhfr,基因带动扩增目的基因的效果因此应该选择,dhfr,基因缺陷的,CHO-,dhfr,-,细胞，以达到抗体的最高表达dhfr基因在CHO细胞中扩增时能在染色体上形成较稳定,谷氨酰胺合成酶,(GS),利用,GS,基因也可对目的基因进行扩增；,GS,基因是一种显性基因扩增选择标志基因，在染色体上可以有较高的扩增倍数，像,dhfr,基因一样，扩增时连带两侧序列一起扩增在外界存在蛋氨酸磺酰胺,(MSX),时。

不表达或弱表达,GS,基因的细胞受到,MSX,的显性筛选死亡，而,GS,基因表达较高的细胞则能存活细胞对,MSX,的耐受浓度与,GS,基因的表达水平呈剂量依赖关系，提高,MSX,的浓度将要求细胞有更高水平的基因表达造成,GS,基因和目的基因的扩增，达到目的基因的高表达谷氨酰胺合成酶(GS)利用GS基因也可对目的基因,表达载体的表达盒,每一个表达载体均带有目的基因的表达盒，表达盒一般包括,启动子、克隆位点以及转录终止信号因为抗体分泌前导肽通常适用于多种抗体基因，所以还可以将抗体分泌前导肽也包,含在表达盒中另外，还可以在抗体分泌前导肽前再加上一些特殊的表达调控序列抗体基,因表达盒的组织形式己较为固定，但其中各元件的选择仍然有值得探讨的地方表达载体的表达盒 每一个表达载体均带有目的基因,1,启动子,抗体基因表达盒中最关键的元件是驱动抗体基因表达的启动子以及相应的增强子所有的真核启动子都含有两个基本组成部分，,TATA,盒和其下游的富含,GC,的序列，,TATA,盒确定了转录起始位点，富含,GC,的序列则决定转录起始频率，因而不同的启动子产生不同的转录起始频率目前使用的哺乳类细胞表达系统的启动于主要有病毒启动子，如,SV40,早期基因 和晚期基因的启动子、人巨细胞病毒立早基因启动子、病毒的长末端重复序列,(LTR),等；哺乳类动物细胞基因的启动子，如转录因于,EF-1,的启动子、人干扰素,-,的启动子、各种鼠,IgG,启动子等。

1 启动子 抗体基因表达盒中最关键的元件是驱,2,核糖体进入位点,启动子下游有真核的核糖体进入位点，它对于所有的抗体基因的表达都是必要的真核的核糖体进入位点通常为,GCCGCC A/GCCAUGG+4,的共有序列，它通过调控核糖体进入,mRNA,起始翻译的频率来影响目的基因的翻译效率，从而影响目的基因的表达水平通常载体均带有核糖体进入位点，但其起始翻译的效率并不太高前面提到的,IRES,具有较强的起始翻译的能力最近的一些研究发现在某些哺乳动物细胞的基因前，存在某些类似,IRES,的序列、可以独立启动翻译，并且产生的翻译效率很高，可以称之为翻译型增强子2 核糖体进入位点 启动子下游有真核,3,转录终止信号和,polyA,加尾信号,载体的转录终止信号和多聚腺苷酸,(PolyA),加尾信号也在很大程度上影响抗体基因的表达转录的终止和,polyA,尾巴的合成影响,mRNA,的有效合成和稳定性强转录终止信号和加尾信号可提高胞浆中能进行有效翻译的,mRNA,浓度，提高表达水平目前使用最广泛的是牛生长激素的转录终止信号和加尾信号,(BGH poly A site),，它的转录终止作用强于,SV40,的。

虽然它也能有效地终止转录，并在以前被广泛采用，但最近的高效表达载体已极少采用另外的此转录终止信号和加尾信号也有被采用的，如人,-actin,的,polyA,和抗体本身的,poly A site,，均获得满意的效果另外，将两个转录终止信号和加尾信号串联使用也可能增强终止转录的强度，例如同时利用抗体恒定区基出组序列的转录终止信号和加尾信号以从载体上具有的,BGH polyA,信号3 转录终止信号和polyA加尾信号 载体的转录终,(,二,),抗体高效表达的其他因素,1,抗体基因的结构,2,抗体表达克隆的筛选,3,宿主细胞的选择和筛选,(二)抗体高效表达的其他因素1 抗体基因的结构,抗体的表达原理课件,有内部核糖体进入位点,有内部核糖体进入位点,抗体的表达原理课件,抗体的表达原理课件,invitrogen,invitrogen,Qiagene,Qiagene,第二节 大肠杆菌表达系统,一 大肠杆菌表达系统的特点,是应用最广的源和表达系统，,产量高，成本低，周期短等特点以下简述原核表达载体的构成元件及特点,第二节 大肠杆菌表达系统一 大肠杆菌表达系统的特点,表达策略,表达策略,一、基因表达信号如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可能合成重组蛋白，因为基因的表达依赖于基因周围的一组信号，这些信号必须能被细菌识别。

这些信号都是一些短的核苷酸序列，为转录和翻译提供信号，三个最重要的信号：,1,）,promoter:,是转录起始信号，在,E.coli,中，启动子必须能被,RNA,聚合酶的,sigma,亚基所识别2,）,Terminator,：转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成,stem-loop,的核苷酸序列3,）核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，转录成,mRNA,分子后，核糖体在这一位点上结合高等生物的基因也被表达信号所包围，但他们的核苷酸序列与,E.coli,的并不相同比较,E.coli,和人类的启动子，有一些是相同的，但是,E.coli,的,RNA,聚合酶不可能结合到人类的启动子上，细菌不能识别人类基因的表达信号一、基因表达信号如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可,解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的,E.coli,表达信号的控制之下这样基因可以转录和表达克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体一）启动子启动子是表达载体的最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了,mRNA,合成的速度获得重组蛋白的数量很大程度上取决于表达载体所携带的启动子。

解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E.,所有,E.coli,启动子都有两个保守序列，保守序列的变化是影响转录效率的主要因素强启动子可以启动高效率的表达，合成大量表达产物相反，弱启动子，在细胞中表达量较低表达载体应该含有强启动子，这样克隆的基因可以以最高的速度表达建立表达载体的另一个需要考虑的因素是启动子的调控，主要有两种调控方式：诱导：一个诱导的基因是在加入底物后基因的表达才能启动抑制：可抑制的基因是在加入调控物后表达被关闭a),启动子的选择,所有E.coli启动子都有两个保守序列，保守序列,真核原核启动子差异,真核原核启动子差异,基因调控是一个复杂的过程，启动子的参与仅仅是间接的许多参与诱导和抑制的序列存在于启动子的周围所以诱导和抑制启动子的化学试剂也同样调控克隆基因的表达如果重组蛋白对细菌有害，其合成必须严格控制在毒性的水平之下可以利用调控物抑制基因的表达即使重组蛋白对寄主细胞无害，仍然需要调控克隆基因的表达，因为持续的高水平表达可以影响重组质粒的复制，最终导致表达产物的下降基因调控是一个复杂的过程，启动子的参与仅仅是间接的许多参,b),表达载体应用的启动子,几种使用频率最高的启动子：,1)lac,启动子：控制编码,-,乳糖苷酶的,lacZ,基因转录的序列，可以被,IPTG,所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。

2)trp,启动子：色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被,3-,吲哚丙烯酸诱导3)tac,启动子：是,lac,和,trp,启动子的杂交分子，比两者都要强，同样可以被,IPTG,所诱导4)PL,启动子：是负责,DNA,分子转录的启动子之一PL,启动子是可以被,E.coli RNA,聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体,DNA,该启动子可以被,cI,基因产物所抑制携带,PL,启动子的载体使用温度敏感的,E.coli cI,突变体在较低的温度下，突变体所产生的,cI,蛋白可以抑制,PL,启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录b)表达载体应用的启动子几种使用频率最高的启动子：,启动子下游的,SD,序列,启动子下游需有,SD(Shine and Dalgarno),序列，这段序列是核糖体结合位点,(RBS),的一部分研究发现,SD,序列为,UAAGGAGG,时比,AAGGA,翻译效率高，起始密码子,ATG,与,SD,序列,UAAGGAGG,的最适距离为,6-8bP,，与,A AGGA,的距离,5-7bP,为好，在分泌表达时需要有前导序列，大肠杆菌中比较常用的几种前导肽序列为,pelB(,果胶酶基因,),、,OmpA(,外膜蛋白基因,),、,OmpF,等，使用何种前导肽对产量影响并不大。

启动子下游的SD序列启动子下游需有SD(Shine and,解释,SD,序列,SD,序列（,Shine-Dalgarno sequence,）：,mRNA,中用于结合原核生物核糖体的序列原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的,SD,序列引导从而识别,AUG,起始密码这段位于,AUG,上游的序列和,30S,核糖体亚基的,16s rRNA,一段序列互补，保守区,5-UAAGGAGGUGA-3,，核糖体结合位点,RBS,和起始密码,AUG,之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意而真核生物的那段保守序列成为,Kozak,序列（,5-GCCACCAUGG-3,），要高效翻译，,+1G,和,-3A,就很重要不过如果,mRNA,没有这段,Kozak,序列而有一段适当长度,5UTR,也能够有效地在无细胞体系中得到翻译有趣的是，还有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得,SD,序列，而真核比如网织红细胞的核糖体能识别,Kozak,序列，也能识别,SD,序列解释SD序列SD序列（Shine-Dalgarno sequ,抗体的表达原理课件,表达产物中需要加入,tag,在表达产物中加入标签序列,(tag squence),后可以方便地利用,ELISA,等常规的免疫学方法进行活性检测、定量及亲和层析纯化产物；通常这段标签位点都置于产物的,C-,末端，这样一般不会影响抗体片段的活性，在进行直接,ELISA,时也能保持标签位点的活性。

目前常用的标签序列有组氨酸串、,FLAG,、,c-myc10,肽及,Strep,标签组氨酸串为,5-6,个组氨酸，它可以与,Ni,+,、,Zn,2+,及,Co,+,等阳离子结合，因此带有,His,的抗体片段可以通过金属螯合层析,表达产物中需要加入tag在表达产物中加入标签序列(tag s,抗体的表达原理课件,富集、纯化疏水性多肽序列,DYKDDDDK,被称为“,FLAG”,也可用于检测和纯化重组蛋白，,它的特点是既可置于,N,末端，又可置于,C,末端C-myc10,肽是鼠单克隆抗体,9E10,的结合表,位该标签的特点是特异件很高Strep,是一段合成的,9,肽，其序列为,AWRHPQFGG,，它能与,链亲合素,(streptavidin),结合，用于柱层析纯化，其不足之处是只能连于,C,末端经改进的,strep tag II(SNWSHPQFEK),的亲和力有所降低，但可以连于,N,端发挥作用富集、纯化疏水性多肽序列DYKDDDDK被称为“FLAG”,二、重组抗体片段的可溶表达,由于可溶表达的抗体可能对宿主菌产生毒性，因此可溶表达载体应选用严格调控的诱导,型启动子来降低本底，过强的启动子因为对大肠杆菌的分泌、加工能力要求过高而并不能增,加分泌表达的产量，有时甚至会降低可溶表达的产量，诱导的强度和持续时间也会影响产物的正确折叠，多数情况下可以利用降低温度来增加可溶表达的产量，经验值为,24-32,度。

二、重组抗体片段的可溶表达 由于可溶表达,抗体的表达原理课件,(,一,),可溶表达的实验方案,从新鲜涂布的平板上挑取单菌落，在起始培养基中培养后转接入,50ml,含抗生素的丰富培养基,(2YT,或,LB),中培养，如果要进行更大体积的培养，则应将单菌落接种在,4ml,丰富培养基中,37,度培养,4-8h,，然后再以此培养基转接至大量培养基如需过夜培养应该在,30,度或更低温度下培养，而不宜在,37,度培养过夜诱导在,37,度培养至,OD,600,约为,0.4-1.0,时开始进行诱导条件因启动子不同而异，参见表,7-2,加入诱导物后继续振荡培养,3h,或过夜培养诱导进行的时间取决于启动子的特性和诱导温度以下列出不同温度下诱导培养的时间的经验值：,15-25,度过夜诱导、,30,度诱导,5-6h,或更长时间、,37,度诱导,3-4h,一)可溶表达的实验方案 从新鲜涂布的,（二）可溶表达条件的优化,1,质粒拷贝数（适中）,2 mRNA,的数量与蛋白质的稳定性,3,抗体片断的折叠与组装,（二）可溶表达条件的优化1 质粒拷贝数（适中）,第三节 抗体在酵母及昆虫细胞中的表达,一、昆虫表达系统及其在基因工程抗体中的应用,1,以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系,统。

2,杆状病毒表达载体（宿主细胞为,sf9,）,3,杆状病毒表达系统的效率与加工能力,4,稳定转化的昆虫表达系统,第三节 抗体在酵母及昆虫细胞中的表达一、昆虫表达系统及,多核多角体病毒,MNPV,特点：,1,具完整的感染性,2,不依赖辅助病毒,3,表达产物多半可溶,4,在自然界生存时间短暂，安全5,不能感染脊椎动物多核多角体病毒MNPV特点：1 具完整的感染性,Invitrogen,公司,Invitrogen公司,新式杆状病毒和昆虫细胞表达系统,特点：,外源基因表达产量高（,1-500mg/L,）；昆虫细胞培养条件简单；昆虫病毒宿主范围窄，不感染脊锥动物细胞，具较高的安全性转化方式：,同源重组：磷酸钙共沉淀法,新式杆状病毒和昆虫细胞表达系统特点：,启动子：,多角体蛋白启动子：非常强，其控制的外源蛋白的表达可达到细胞蛋白的,30,P10,蛋白启动子,已有系统：,Clontech,公司的,BacPAK,TM,杆状病毒表达系统，,IPLB-Sf21 Cells,，提供两个转移质粒：,pBacPAK8,和,pBacPAK9,启动子：,BaculoDirect,杆状病毒表达系统是生产重组杆状病毒最快和最容易的方法,不需要烦琐的细菌转化和,bacmid,的分离，或是将转移载体和线性杆状病毒,DNA,共转染进昆虫细胞。

经过生物工程改造的,BaculoDirect,线性,DNA,（杆状病毒基因组），利用快速和有效的,Gateway,重组反应代替了这些烦琐的工作使用,BaculoDirect,系统，从最初的反应混合物的转染到杆状病毒苗的分离，只需要花费大约,8,小时,仅花费了不到传统方法一半的时间！,BaculoDirect杆状病毒表达系统是生产,BaculoDirect,系统利用快速、简便的,Gateway,技术,BaculoDirect,线性,DNA,包含了,attR,位点，允许与包含有目的基因的,Gateway,入门克隆进行有效的重组将,entry,克隆、,BaculoDirect,线性,DNA,和,Gateway,LR,Clonase,酶混合物稍加混匀，在室温下反应,1,小时即可最终的反应混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒，可以直接用于转染昆虫细胞（,sf9,或,sf21,）BaculoDirect系统利用快速、简便的Gatewa,酵母表达载体,酵母表达载体,一、外源基因在毕赤酵母中的表达,特 点,：,酵母生长快，易培养，成本低，遗传操作方便，对外源蛋白能进行翻译后修饰和加工毕赤酵母利用,AOX1,强启动子或者,3-,磷酸甘油醛脱氢酶（,GAPDH,）启动子，可高效表达外源基因。

毕赤酵母的细胞密度可达,150g/L,毕赤酵母可进行糖基化，糖基化位点（,Asn-X-Ser/Thr,）,一、外源基因在毕赤酵母中的表达特 点：,毕赤酵母表达外源蛋白通常步骤：,外源基因表达载体的构建,载体,DNA,导入酵母细胞,筛选表达载体染色体整合的菌株,捡出外源蛋白表达情况,优化发酵条件建立高密度发酵方法,建立外源蛋白纯化工艺,毕赤酵母表达外源蛋白通常步骤：,二、酵母表达系统,酵母是一类单细胞真核生物，具备易于操作，遗传背景清楚，生产成本低等原核生物的特点，又具有真核生物的折叠、分泌机制，可以完成真核生物特异的蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程酵母的生长速度（,1-3h/,代）比昆虫或其它动物细胞（约,l d/,代）快许多，培养基成分简单使用无血清培养基更可以简化蛋白产物纯化过程，在酵母表达系统中应用最多的是酿酒酵母和毕赤酵母酿酒是使用最早，应用最广的酵母菌株但目前有被毕赤酵母取代的趋势与酿酒酵母相比毕赤醉母有几个突出的优点，它的乙醇氧化酶基因（,AOXI,）是一个甲醇诱导表达的严格调控基因，启动活性高，渗漏低在加人甲醇后可以迅速启动转录；它比酿酒酵母更适合高密度培养，这对于提高重组蛋白的产量至关重要；它的,N,糖基化方式也更接近高等真核生物。

对该体系的载体构建、表达特点和体系优化已经进行了系统研究二、酵母表达系统 酵母是一类单细胞真核生物，具,抗体的表达原理课件,（一）酵母表达系统的特点,在酵母表达系统中常用的载体可按复制形式分为,Yip,、,Yrp,、,Ycp,、,Yep,和,YAC,几种pPIC9K,为常用的酵母表达载体，其组成元件如图，一,3,所示除,AOXI,启动子外常用的还有,GAL,系列启动子；分泌表达还需要前导肽将产物引导至分泌途径酵母天然的前导肽不一定适用于所有外源蛋白，来源于酿酒酵母的,-MF,前导肽为常用的前导肽检测或分离重组蛋白可以选择,His,、,c-myc,等与大肠杆菌的质粒载体相似的标记序列一）酵母表达系统的特点在酵母表达系统中常用的载体可按复制形,研究发现在,E coli,中以包含体方式表达的蛋白在酵母中大都能可溶表达，征大肠杆菌中经常发生的蛋白降解现象，在酵母中也有所改善酵母表达系统的产量比原核表达系统要高在适当的前导肽引导下可以分泌到培养基中，其培养基中的污染物种类很少有助于简化纯化过程wood,等于,1985,年就在酿酒酵母中成功地表达了能正确折叠、并且有生物功能的完整抗体分子到目前为止，完整的抗体、抗体片段如,Fab,、,ScFv,等抗体分子均已在酵母中得到表达。

分泌的重组抗体片段在酵母中也可以高水平表达研究发现在E coli中以包含体方式表达的蛋白在,(,二,),酵母表达抗体片段的局限,酵母可以完成和高等真核生物极其类似的,O-,糖基化及,N-,糖基化，但酵母的,O,和,N-,糖基的主要成分为甘露糖N-,糖基化时添加的糖链长度会影响所表达蛋白的性质在酵母中的糖链,(50,个糖基,),比哺乳动物的糖链,(20,个糖基,),长许多，称为过度糖基化这种过度糖基化产生的长链可能会影响蛋白的折叠，影响抗体的活性，具有免疫原性有人报道酵母表达的,IgG,抗体虽可以介导,ADCC,，但却不能激活补体系统二)酵母表达抗体片段的局限,这类抗体分子还因为可能具有免疫原性及在血液中易被消除而不适用于临床治疗抗体分子在酵母表达时会否发生过度糖基化以及这种过度糖基化是否合影响抗体的活性还很难确定酵母表达系统的不足之处还在于它的分泌表达模式与高等真核生物的差别会造成某些蛋白不能正常分泌而滞留在分泌途经中这可能是因为酵母对前导肽的识别能力以及细胞器的功能与高等真核生物不同，改用酵母天然的前导肽可以改善某种蛋白的分泌状况，但不具有普遍意义这类抗体分子还因为可能具有免疫原性及在血液中易被消除而不适用,第四节 动植物表达系统,一 动物表达系统,二 植物表达系统,第四节 动植物表达系统一 动物表达系统,一、哺乳动物细胞表达系统,特点：,能进行复杂的蛋白翻译后加工修饰,一、哺乳动物细胞表达系统特点：,1,、影响外源基因在哺乳动物表达的序列因素,启动子：,起始位点上游,20bp,处的,TATA,盒,RNA,聚合酶开始装配和转录的地方,CAAT,盒,GC,盒,调节转录的起始。

1、影响外源基因在哺乳动物表达的序列因素启动子：,增强子：,增强子序列是决定基因表达强度基因表达空间与时序的重要元件SV40,增强子,人巨细胞病毒（,CMV,）增强子,逆转录病毒,LTR,增强子,增强子：,RNA,剪接位点和内含子：,内含子一般含有决定基因表达强度和时空专一性的构件，一些启动子可和内含子相互作用提高表达水平5,非翻译区序列（,5,UTR,）：,5,UTR,的长度至少大于,20bp,起始,AUG,及其周围序列：,3,非翻译区（,3,UTR,）：,RNA剪接位点和内含子：,已发展和使用的病毒载体有：,SV40,病毒载体，腺病毒载体，多瘤病毒载体，牛痘痘苗宾服度载体，单纯泡疹病毒载体，逆转录病毒载体，腺病毒相关病毒载体，,EB,病毒载体，牛乳头瘤病毒载体等2,、哺乳动物细胞的表达载体,已发展和使用的病毒载体有：2、哺乳动物细胞的表达载体,3,、筛选标记基因,是细胞产生特定的药物抗性或产生荧光常用的筛选标记有：,氨基糖苷转移酶（,APH,或,neo,r,），潮霉素,B,磷酸转移酶（,hyg,），二氢叶酸还原酶（,dhfr,）等,3、筛选标记基因是细胞产生特定的药物抗性或产生荧光。

4,、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式,瞬时转染：,永久转染,4、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式瞬时转染：,5,、外,DNA,导入哺乳动物细胞的方法,病毒方式：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、泡疹病毒、腺病毒相关病毒,磷酸钙共沉淀法、,DEAE-,葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法,显微注射，电转移法、基因枪,转染：,化学法：,物理法：,5、外DNA导入哺乳动物细胞的方法病毒方式：逆转录病毒、腺病,四、基因表达产物的检测,基因转录水平的检测：,Northern Blot,，,RNA,杂交保护，,RT-PCR,蛋白翻译水平的检测：,ELISA,、,Western Blot,，高压液相，质谱等,生物活性的检测：,四、基因表达产物的检测基因转录水平的检测：Northern,第六章,基因打靶,概念：,基因打靶，基因敲除，干细胞，基因敲入,基因打靶的技术流程,第六章 基因打靶概念：基因打靶，基因敲除，干细胞，基因敲入,基因打靶,胚胎干细胞的获得和培养,打靶载体的构建,重组,ES,细胞的筛选,嵌合体小鼠的制备,基因敲除小鼠的建立,Cre-loxP,系统、,FLP/FRT,系统和条件性基因敲除,基因敲入,大规模,ES,细胞突变库的建立,基因打靶胚胎干细胞的获得和培养,概 念,干细胞,是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。

胚胎干细胞,（,Embryonic Stem Cell,，,ES,),：,ESC,是从早期胚胎内细胞团（,Inner Cell Mass,，,ICM,）或附置后胚胎原始生殖细胞（,primordial germ cells,PGCs,),分离克隆出来的一种具无限增殖能力和全向分化能力的干细胞胚胎干细胞的定义：,概 念干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可分为胚胎,ES,的特点：,（,1,）全能性,这个特点是,ES,细胞具有可塑性的基础，优于成年组织干细胞2,）无限扩增,为实验和应用提供了大量的原材料或工具3,）可操作性,导入异源基因，报告基因或标志基因，诱导某个基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之过度表达ES的特点：,胚胎干细胞（,ES,细胞）,：,是一种具有分化潜能的细胞，在体外培养条件下能无限分裂并保持其全能性一定培养条件下，,ES,细胞能在体外形成拟胚胎，具中胚层、内胚层和外胚层特征将,ES,细胞注入小鼠囊胚，该囊胚能在体内发育成,嵌合小鼠,，,注入的,ES,细胞能发育成小鼠的各个组织器官，包括生殖细胞ES,细胞的这些特点为原位定点改造小鼠个体的基因组创造了可能胚胎干细胞（ES细胞）：是一种具有分化潜能的细胞，在体外培养,基因打靶,：,是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。

基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构,基因敲除：,是使基因组中某个,/,某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能基因敲入：,在个体基因组中定点加入某个,/,某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能基因敲除：是使基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺,基因打靶技术,是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段它的产生和发展建立在,胚胎干细胞技术,和,同源重组技术,成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展自,1987,年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，,成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一,基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段它的产,基因打靶流程图,一、胚胎干细胞的获得和培养,基因打靶中用的小鼠,ES,细胞系有：,D3,、,E14,、,R1,、,J1,、,CCE,，,均来源于,129,小鼠品系和其杂交品系。

ES623,和,B6-IIIES,细胞系,，来源于,C57BL/6,小鼠品系BALB/c-I,，,来源于,BALB/c,小鼠品系,常用的饲养层细胞为,PMEF,（小鼠原代胚成纤维细胞）,一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：,ES,细胞的培养,（,1,）冲洗子宫获得胚泡,（,2,）分离胚泡内细胞团,组织培养法、免疫外科学法、显微外科学法,（,3,）体外培养,有饲养层培养：,STO(,一种已建株的胚胎成纤维细胞,),经,丝裂霉素,C,或,射线处理，终止其分裂,，但能分泌促进,ESC,分裂抑制其分化的因子无饲养层培养：,利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备,条件培养基,，或向其中加入,LIF,（白血病抑制因子）,1,、基因打靶用,ES,细胞的建株,ES细胞的培养1、基因打靶用ES细胞的建株,组织培养法分离胚胎干细胞,组织培养法分离胚胎干细胞,1,2,3,ES,细胞,123ES细胞,转基因动物表达系统表达抗体,在大肠杆菌、酵母或昆虫细胞中都很难获得与哺乳动物翻译后修饰、加工，特别是糖基化方式一致的重组抗体在细胞培养条件下的蛋白表达与活体条件下的表达和调控也有很大区别用于抗体规模化生产时，细胞培养的成本过高会制约其应用，小规模培养时这个问题更为突出。

利用转基因动物作为生物反应器来生产重组抗体可以解决这一难题目前转基因方法很多，在转基因小鼠上广泛应用的主要有两种方法：,当基因整合位点不是主要因素时，将,DNA,直接注射到受精卵的精核中可以向小鼠基因组引入新基因；,把,DNA,引入胚胎干细胞,(ES,细胞,),的培养物中，这种办法通过基于同源重组的基因敲除来获得目的基因的稳定表达，这两种转基因的过程见图,7-6,转基因动物表达系统表达抗体 在大,(,一,),乳腺特异的调控序列,目前主要是在转基因动物的乳腺中表达外源蛋白，在乳腺中表达的抗体片段大多是与乳腺特异调控序列融合表达的嵌合蛋白，许多编码乳汁成分蛋白的调控区被用于重组蛋白在乳腺中的定位表达，如羊的,-,乳球蛋白，牛的,-,酪蛋白等这些调控序列在应用时对抗体的表达量无太大影响，也没有明显的种属特异性，但相同的抗体片段融合于不同的调控区时，表达量有所差异用于表达的抗体基因既可以是包括内含子的基因组,DNA,，也可以用,cDNA,然而将外源抗体的,cDNA,序列连在这些调控区下游时却很难获得高效表达，选用较大的基出组片段,(20kb),效果要好许多一)乳腺特异的调控序列 目前主要是在转基因,（二,),转基因动物的选择,小鼠、羊、牛和鸡等多种动物都可用于转基因的研究和生产。

选择何种动物主要考虑产量和所表达抗体的性质二)转基因动物的选择,抗体的表达原理课件,植物表达系统,利用转基因植物作为生物反应器来生产重组蛋白始于,20,世纪,80,年代，伴随这项技术的日臻完善，出现了诸如“分子农业”以及“变植物为工厂,)”,等概念在植物表达系统中生产的抗体称为植物抗体,(plantibody),，它们可以是,FV,、,ScFv,、,Fab,乃至全长抗体，要获得临床前及,I,期临床实验用转基因植物约需,2,年左右时间利用植物表达外源蛋白有许多优点，首先植物繁殖能力强，可以利用愈伤组织或原生质体连续培养也可以从这些材料出发获得再生植株，这方面已经积累了很多的经验其次，大多数植物的基因转化都是把外源,DNA,整合到基因组中去获得转基因植株，这样就可以利用有性杂交在材料间转移基因植物表达系统 利用转基因植物作为生物反应器来生,在植物转化中应用最多的方法是农杆菌介异的转化利用不同的启动子可以实现,ScFv,在细胞质、内质网、叶绿体及细胞间隙中的表达农杆菌胭脂碱 合成酶基因（,nos,）和花椰菜花叶病毒（,CaMV),的,35s,启动子是常用的启动子单子叶植物更多使用泛素的启动子。

此外也可选择组织器官特异的启动子，抗性基因的选择以新霉素磷酸转移酶（,nptII,），潮霉素磷酸转移酶（,hpt,）及氯霉素乙酰转移酶（,cat,）为主也可以使用葡萄糖甘酸酶（,GUS,）及绿色荧光蛋白（,GFP),等报告基因作为筛选标记pBin19,是应用较广的,Ti,质粒载体其基本结构如图,7-4,在植物转化中应用最多的方法是农杆菌介异的转化,Ti,质粒的特点,Ti质粒的特点,抗体的表达原理课件,Ti,质粒载体示意图,Ti质粒载体示意图,（一）全抗体及,Fab,片段的表达,到目前为止,IgG,、,IgM,、,IgA,等多种形式的抗体和各类小分子抗体片段都可在植物细胞中表达最初是采用分别转化了重链和轻链基因的转基因植株进行杂交从后代中筛选出能生成全抗体的个体199 9,年,During,等将轻、重链基因克隆入同一个表达载体中后转化烟草这样可以简化操作程序，缩短育种年限全长抗体要完成正确的折叠和装配过程才能成为有功能的抗体分子在哺乳动物细胞中新合成的蛋白质在前导肽的指导下进人内质网内腔，前导肽在内质网中切除已知至少有两种胁迫蛋白,Bip/GRP78,和,GRP94,作为分子伴侣与未经组装的轻、重链结合，指导其完成在内质网内的折叠与组装。

在植物中完成组装过程时，轻，重链要同时带有前导肽此前导肽可以来源于小鼠、植物或酵母一）全抗体及Fab片段的表达 到目前为止,目前仅有植物表达系统能大规模的商品化生产分泌型,IgA(SIgA),这一独特的抗体利用杂交瘤技术只能获得单体,IgA,，不能形成二聚体，采用化学偶联虽然可以得到,SIgA,，但不能大量生产通过将,SIgA,的四种成分的基因分别转移到烟草中，经杂文选育获得了能生产,SIgA,的转基因烟草目前仅有植物表达系统能大规模的商品化生产分泌型IgA(SIg,(,二,)ScFv,的表达,在植物器官种子、块茎以及叶片中都可以表达,ScFv,等小分子抗体因为单链抗体经正确折叠后不需装配就具备相应的抗原结合能力，所以理论上可以在植物细胞的任何部分甚至外周质中表达ScFv,在叶片中的表达量可至,0.01,-0.1,总可溶蛋白,(total soluble protein TSP),在抗体片段的,C-,端融合,KDEL,信号可以明显提高,ScFv,在细胞溶质中的表达量，在细胞外周质和内质网中的表达量可以达到,1,-6.8,TSP,在内质网中存在分子伴侣可以协助完成正确的折叠过程，防止发生聚集，所以延长,ScFv,在内质网中滞留时间有助于完成正确的折叠过程，提高稳定性和产量。

二)ScFv的表达 在植物器官种子、块,种子及块茎是天然的蛋白贮藏器官，其中的蛋白可以长期不被降解，选择种子特异的启动子有助于定点表达重组抗体，也可简化纯化过程目前常用的种子特异启动子有两个，即,1eB4,和,USP,启动子在,leB4,启动子驱动下的,ScFv,可以获得,0.6,TSP,产量储存,1,年后，其活性无明显改变除烟草种子外，马铃薯的块茎也可用于表达和累积抗体片段种子及块茎是天然的蛋白贮藏器官，其中的蛋白可以长期不被降解，,(,三,),影响植物抗体衷达的因素,1,载体元件的作用,CaMV 35s,启动子在大多数转基因植株中为组成型的强启动子，现在已经对启动子,CaMV 35s,进行了许多修饰以提高外源基因的表达水平在原生质体中的瞬时表达研究中发现双,35s,启动子可提高基因的表达水平达,10,倍，但在烟草和番茄中，双,CaMV 35s,增强于并未能提尚表达，与之相比，由甘露糖化谷氨酰胺合成酶基因启动子部分序列与,CaMV 35s,启动子的增强子区域融合而成的杂合启动子,Mac,可驱动高效表达，可将叶片中的表达员提高,3-5,倍、根部表达量提高,10-15,倍三)影响植物抗体衷达的因素 1载体元件的作用,在种子、块茎或果实等器官或组织中特异表达抗体片段时除应使用组织特异的启动子外，还应考虑选择适当的前导肽序列。

连有前导肽的,ScFv,表达水平要比对照高,5-9,倍将目的蛋白定向表达到适当的细胞分隔也可增加目的蛋白的稳定性并提高得率外源蛋白可定向到,3,个细胞分隔：细胞质、质外体和内质网腔,(,图,7-5),在种子、块茎或果实等器官或组织中特异表达抗体片段时除应使用,抗体的表达原理课件,2.,末端多肽的作用,在,ScFv,的,C,末端增加一段内质网滞留信号,4,肽,KDEL,，可以显著提高表达量仅有前导肽而无此信号的表达量为,0.01%TSP,仅有,KDEL,信号时表达量为,0.2%.,两个信号都有时为,1.0%,两个都无时则检测不到,ScFv,的存在2.末端多肽的作用,3,蛋白质稳定性,现在对基因转录、转录后加工和翻译进行的研究较多，但对植物中决定蛋白质稳定性的因素了解较少，如果能够延长外源蛋白的半衰期，不需要额外的能量消耗就能提高外源蛋白的产量，因此选择在种子、块茎等器官中表达的抗体片段稳定性较好全长抗体在植物的不同物种和组织中装配能力不同，烟草和拟南芥对,IgG,的装配能力相当,而,Fab,在拟南芥及其愈伤组织中都比烟草中的装配水平高,;,不同组织中重组抗体的装配能力也有差别，烟草愈伤中为,24%,叶片中为,95%,。