可溶性糖测定.docx

    可溶性糖测定    引言可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等单糖和双糖，是植物品质的重要构成性状之一，尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品质的重要因素对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风味淡，品质差因此，可溶性糖的定量研究对植物的品质育种、储藏、加工特性等具有重要意义而且可溶性糖广泛存在于植物的根、茎块和种子中，是人体热量的最最主要来源，具有较高的营养价值本文重点介绍蒽酮比色法、铜还原碘量法、费林试剂法、原子吸收法、气相色谱法、液相色谱-蒸发光散射法，及连续流动法这几种实验如何定量测定可溶性糖含量1 蒽酮比色法1.1 原理糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关在625 nm波长下的OD值与糖含量成正比由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色1.2 仪器与材料1.2.1实验仪器分光光度计，电炉，铝锅，电子天平，20ml刻度试管，刻度吸管5ml 1支、1ml 2支，漏斗1.2.2实验试剂（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。

2）浓硫酸（比重1.84）1.2.3实验材料植物叶片1.3 实验方法1.3.1标准曲线的制作取20ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水表1 各试管加溶液和水的量管号 0 1、2 3、4 5、6 7、8 9、10 100μg/ml蔗糖液0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(ml)水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0蔗糖量(μg) 0 20 40 60 80 100然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色然后以空白为参比，在485nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程按表1加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程1.3.2可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。

分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min （提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度1.3.3显色测定吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度1.3.4结果计算可溶性糖含量(mg/g) = （从回归方程求得糖量/吸取样品液的体积）×提取液量×稀释倍数÷样品干重×10-62 铜还原碘量法2.1 原理试剂中的Cu2+与还原糖作用，生成氧化亚铜(Cu2O)沉淀加入H2SO4后，氧化亚铜溶解生成Cu+,试剂中的KIO3与KI在酸化的同是生成I2KIO3+5KI+3H2SO4→3K2SO4+3H2O+3I2，然后Cu+被I2氧化，2Cu++I2→2Cu+ + 2I-溶液中剩余的碘以淀粉为指示剂，用Na2S2O3标准溶液滴定：Na2S2O3+ I2→Na2S2O6 + 2NaI同时以水代替样试液做空白滴定，将空白与样品的滴定差值带入由滴定标准系列糖液计算的回归方程中，即可求得所求试样中还原糖的含量2.2 仪器与试剂2.2.1实验试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和GB∕T 6682 规定的至少三级水。

氢氧化钠溶液碱性铜试剂，盐酸溶液[c（HCl）=1mol∕L]，亚铁氰化钾溶液{w[K4Fe （CN）6·H2O=15％]}，硫酸锌溶液[w(ZnSO4·7H2O）6·H2O=30％]，硫酸+草酸混合液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠工作溶液[c（Na2S2O3）=0.005mol∕L]，淀粉指示剂，酚酞指示剂，氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.5mol∕L]，葡萄糖标准液2.2.2仪器和设备分析天平，高速组织捣碎机，电磁炉、可调温电炉或恒温水浴锅，25mL滴定管，（酸式、减式皆可），鼓风干燥箱2.3 实验方法2.3.1样品制备（1）新鲜样品：取有代表性的样品，洗净，把水吸干，用四分法取样，切碎，混匀，用组织捣碎机匀浆黄瓜，番茄等多汁蔬菜可直接制成匀浆其他样品蔬菜可称取切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆，韭菜等水分较少的蔬菜可称取切碎混匀的样品100.0g，加入200mL水制成匀浆去相当于10g样品的匀浆，精确到0.01g，用水洗入100mL容量瓶（V1）中，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL（如菜豆累高蛋白蔬菜可加入2mL）摇匀后定容，放置片刻，等沉淀分离后过滤备用。

2）干制品：将样品至于63℃~67℃鼓风干燥后，用粉碎机粉碎，过0.5mm筛去1.00g~2.00g粉碎的样品防雨烧杯中，加入少量水湿润，用水洗入100mL容量瓶中，用沸水浴加热10min，冷却后，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL，摇匀后定容，过滤后备用3）制品各种酱腌菜：去切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆蔬菜罐头可直接制取匀浆，操作步骤同5.1番茄酱混匀后，可直接制取5.00g样品用水洗入100mL容量瓶同5.1操作蔬菜汁称取混匀的样品20.00g用水洗入100mL容量瓶同5.1操作2.3.2还原糖的鉴定（1）标准曲线的制作：用移液管吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的葡萄糖标准液与100mL锥形瓶中，或200mm×25mm的试管中，各加水至5.0mL，加入5mL的铜试剂，锥形瓶或试管口上加小漏斗，用相应的架子固定，置于沸水浴中加热15min取出后立即置于冷水中，冷却至25℃到30℃将加盖小漏斗更换为表面皿（不可摇动）加入2mL硫酸+草酸的混合液，立即摇动，使氢氧化亚铜完全溶解用硫代硫酸钠工作溶液滴定至浅黄绿色时，加入约0.5mL的淀粉指示剂，滴定至蓝色消失为终点。

以糖的含量（mg）为y，空白与糖液滴定差值为x，计算回归方程y=bx+a并计算出a和b的值标准曲线于没新配一次铜试剂和硫代硫酸钠储备液制备一次即可2）试样还原糖的测定：根据不同样品中糖的含量，用移液管吸取5mL～10mL(V2)与50mL或100mL(V3)于容量瓶中.用水定容(含糖量低的样品不作次稀释处理)从容量瓶中吸取5.00mL（V5）与锥形瓶或试管中，加入5.00mL的铜试剂以下按6.1.1标准曲线的制作步骤操作记录滴定值（V4）同时以水代替试样作空白（可不加热）将试样与空白滴定差值带入回归方程即可算出试样中还原糖的含量如试样与铜试剂加热反应后，砖红色氧化亚铜的含量较多看不到蓝色，则样品含糖量偏高，可酌情吸取1mL～4mL样液，加水至5.00mL测定滴定值应不少于标准曲线的最高点3）试样可溶性总糖测定：用移液管吸取5mL～10mL与50mL或100mL于容量瓶中，加入1mL的盐酸溶液，置于沸水浴中加热10min，冷却，加入酚酞试剂1～2滴，用约0.5mol∕L氢氧化钠溶液中和至红色，再用稀盐酸调定红色刚刚消失，定容以下按还原糖步骤操作[1]2.3.3结果计算试样中可溶性总糖的的含量以质量分数w1计，单位以百分率（％）表示，计算式如下：W1=[a+b(V0-V4)×V1×V3]/V2×V5×m×10003 费林试剂法3.1 原理在沸热条件下,用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时将费林试剂中的二价铜还原为一价铜,以亚甲基蓝为指示剂,稍过量的还原糖立即使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝。

3.2 仪器与试剂3.2.1仪器设备高速组织捣碎机，电热恒温水浴，1000W调温电炉，200ml,250ml容量瓶，250ml 锥形瓶，50ml碱式滴定管3.2.2实验试剂（1）费林试剂甲：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O，分析纯)34.6g溶于水中，稀释至500ml，过滤，贮于棕色瓶内2）费林试剂乙：称取氢氧化钠50g和酒石酸钾钠(KNaC4O6H4·4H2O，分析纯)138g 溶于水中，稀释至500ml,用石棉垫漏斗抽滤3）转化糖标准溶液：称取9.5g蔗糖(分析纯)用水溶解后转入1000ml容量瓶中，加入6MHCl(分析纯)10ml,加水至100ml在20～25℃下放置三天或在25℃保温24h，然后用水定容(此为酸化的1%转化糖液,可保存3～4个月)测定时，取1%转化糖液25.00ml放入250ml容量瓶中,加入甲基红指示剂一滴，用1MNaOH溶液中和后用水定容，即为1mg/ml转化糖标准溶液4）亚甲基蓝溶液：称取0.5g亚甲基蓝(分析纯)溶于100ml水中5）乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌［Zn(OAC)2·2H2O，分析纯］溶于水中，加冰乙酸3ml，稀释至100ml6）亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6·3H2O,分析纯］溶于水，稀释至100ml。

3.3 实验方法3.3.1样品提取液制备取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分法取样称取100g鲜样加入等重量的水，放入组织捣碎机中捣成1:1匀浆，有些材料匀浆比例可适当调整，多汁果蔬类可直接捣浆称取匀浆25.0或50.0g(相当于样品12.5或25.0g)放入150ml烧杯中，含有机酸较多的材料加0.5～2.0g粉状CaCO3调至中性(广范试纸检试)用水将样液全部转入250ml容量瓶中，并调整体积约为200ml置80±2℃水浴保温30min，其间摇动数次，取出加入乙酸锌溶液及亚铁氰化钾溶液各2～5ml,冷却至室温后，用水定容，过滤备用3.3.2可溶性糖测定（1）费林试剂的标定：取费林试剂甲、乙各 5.00ml或在测定前先等体积混合后取10.00ml混合液于250ml锥形瓶中,放入玻璃珠4～5粒,先加入比预测(按6.2进行预测)仅少0.5ml的1mg/ml转化糖标准液将此混合液置1000W电炉上加热,使其在2min 左右沸腾,准确煮沸2min,此时不离开电炉,立即加入0.5%亚甲基蓝指示剂6滴,并继续以每4～5s的滴速滴加标准糖液,直至二价铜离子完全被还原生成砖红色氧化亚铜沉淀,溶液蓝色褪尽为终点。

用准确滴定标准糖液的毫升数V1,乘以标准糖液浓度［mg/ml］,即得10ml费林试剂所相当的糖的毫克数取已经制备的待测液100ml于200ml容量瓶中,加6MHCl10ml在80±2℃水浴加热10min,放入冷水槽中冷却后,加甲基红指示剂二滴用6M及1MNaOH溶液中和,用水定容2）预测：取费林试剂甲、乙各5.00ml或10.00ml混合液于250ml锥形瓶中,，滴定管加入待测糖液约15ml,在电炉上加热至沸，约沸15s后迅速滴加待测糖液,至呈现极轻微的蓝色为止，此时加入0.5%亚甲基蓝指示剂 6 滴，继续滴加待测糖液，直至溶液蓝色褪尽为止，记下待测糖液的用量V2(毫升数)3）准确测定：取费林试剂甲、乙各5.00ml或10.00ml混合液加入锥形瓶中，由滴定管加入比预测仅少0.5ml的待测糖液，并补加V1－V2 毫升水(标定费林试剂所消耗的标准糖液毫升数V1减去预测消耗的待测糖液毫升数V2,即为应补加水的毫升数)，使其与标定费林。