消化毒剂的作用机理.ppt

第五节 消化毒剂的作用机理1996年，吴文君等首次提出了消化毒剂的概念，把主要作用于昆虫消化系统，即主要以消化系统为初始靶标的杀虫剂为 消化毒剂破坏中肠 中肠组织破坏剂影响消化酶系 消化抑制剂 主要种类： Bt内毒素植物源次生代谢物，如二氢沉香呋喃类化合物等 两类靶标一、 Bt内毒素苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt），产品已达60余种 ，是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂 基本作用原理 Bt的杀虫活性主要是其产生的杀虫蛋白晶体在起作用杀虫蛋白晶体，也叫原毒素（protoxin），是由多个杀虫晶体蛋白（ insecticidal crystal proteins,ICPs）或δ-内毒素（δ- endotoxin）或Cry（晶体）蛋白的亚单位组成昆虫摄食该毒蛋 白后，在中肠的高pH环境和蛋白酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并 被激活，引起试虫中肠膜上皮细胞裂解症状：试虫失去运动能力，不停地颤抖，呕吐，停止取食，死亡 1. Bt杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis ，Bt)所产生的毒素。

毒蛋白主要有7种：A2外毒素、B2外毒素、C2外毒 素、δ-内毒素、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子 外毒素δ-内毒素是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶体 ，位于芽孢之旁，所以又称伴孢晶体毒素，是主要的 杀虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素 (Pretoxin)，经过激活，即消化成分子量为1000～ 70000的片段，才起毒素作用晶体蛋白有130多种，按照杀虫范围和寄主同源型 又可分为两大类群，即Cry 蛋白和Cyt蛋白Cry在活体和离体条件下只对鳞翅目、双翅目或鞘 翅目有效；Cyt活体条件下只对双翅目有效，而离体条件下具 有广谱性Cry分为四大类（根据杀虫谱）：CryI（鳞翅目） 、CryII(鳞翅目和双翅目)、CryIII（鞘翅目）和 CryIV(双翅目)通常一种毒素只能杀死某一目的部分易感昆虫， 对有益生物和脊椎动物安全1. Bt杀虫晶体蛋白（ICPs）完整的毒蛋白一般由三个结构域组成结构域Ⅰ由一个α-螺旋束组成，可能与细胞膜 穿孔有关；结构域Ⅱ由三组β-折叠片层组成，可能参与了 毒素与膜受体蛋白的识别和结合；结构域Ⅲ位于毒素分子C-端，则可能能够防止昆 虫肠道蛋白酶对毒性肽分子的进一步降解。

1. Bt杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）2. Bt毒素受体蛋白晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白结结合的能力 呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白专专一性的决定因子 ①昆虫中肠Bt毒素受体蛋白主要为存在中肠的刷状 缘膜囊泡(BBMV)的氨肽酶N (aminopeptidase N，APN)（ 肽链肽链 端解酶，催化蛋白氨基末端残基的分裂 ）②烟草天蛾中肠BBMV上Cry1Ab毒素的受体BT-R1，证 明它是一种类钙粘蛋白(cadherin-like)③尖音库蚊幼虫中肠中球形芽孢杆菌晶体的Bin毒素 受体可能是一种α-葡糖苷酶 δ-内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体 结合、插入、孔洞或离子通道形成等五个环节昆虫取食孢子和毒素毒素被蛋白酶活化毒素与膜受体结合毒素造成膜穿孔使细胞裂解3. 杀虫晶体蛋白的作用机理毒素的溶解 晶体蛋白可以溶解于pH >12或pH >9.5并加有巯基试剂的碱性溶液中中肠内环境诸如pH值、还原电势、去垢性、体积等都可能影响δ-内毒素在昆虫体内的溶解性鳞翅目幼虫的中肠pH值一般都较高，呈碱性, 对δ-内毒素的溶解很有利。

3 杀虫晶体蛋白的作用机理 毒素的活化 溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由130kD左右的前毒素，打开二硫键，释放出N 端的70kD左 右的抗酶多肽活力片段活力片段至少由两部分组成, 即毒力片段和细胞结 合片段毒力片段位于N端, 由几个保守的亲水区组成， 主要结构是α-螺旋，对于跨膜通道的形成及毒效可能起着重要作用细胞结合片段由C端的保守区和中间的可变 区组成，主要结构是β-片层，负责毒素与靶标昆虫受体 的结合，从而决定了毒素的选择性中肠酶液的组成直 接影响到δ-内毒素的降解活化, 对δ-内毒素作用的专 一性起着重要作用 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 毒蛋白的活化过程被昆虫取食的晶体蛋白在中肠被溶解碱性环境成熟毒素被中肠蛋白酶消化活化毒素的活化 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 3 杀虫晶体蛋白的作用机理 毒素与受体蛋白的结合 毒素被活化以后，毒素首先是通过结构域Ⅱ与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结合结合分为两步，第一步即初始结合( Initial Binding)，结合上的毒素可以再次与受体发生解离，故又称可逆性结合(Reversible Binding)；初始结合之后，毒素进一步与膜受体蛋白发生紧密结合或直接插入细胞膜,此时的毒素与受体难以发生解离,故为不可逆性结合( Irreversible Binding)。

插入及孔洞或离子通道的形成 活化的毒素与刷状缘膜上的受体结合后，结构域Ⅰ插入膜内，形成孔洞或离子通道，导致膜完整性的破坏，引起离子渗漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、死亡3 杀虫晶体蛋白的作用机理 (+)结构域 I α-螺旋束3 杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域Ⅰ在杀虫蛋白中的作用 Cry蛋白的结构域Ⅰ是由6-7个两亲的α-螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋形成的定点突变结果表明, 结构域Ⅰ可能是通过自身的带正电荷残基与带负电荷的膜表面接触的对 于结构域Ⅰ在膜上形成穿孔的机制，认为是结构域II在完成毒素 -受体识别后，结构域Ⅰ受毒素-受体结合的诱导要发生重大构象 变化，周围围的两亲亲α-螺旋向外翻，由α-4螺旋与α-5螺旋构成 的“轴轴”突出，4个毒素分子的α-5螺旋相互靠近形成孔道的内壁 ，而4个α-4螺旋则则形成孔道的外壁，孔道穿透整个磷脂双层层， 细细胞外的水大量内流，导导致细细胞胀胀裂 α-5螺旋α-4螺旋α-5螺旋细胞膜α-4螺旋细胞膜图2 Bt杀虫毒蛋白作用的伞型模型与形成孔道原理示意图H2O3 杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域Ⅱ由3个β-折叠片层组 成，主要进行毒素与受体蛋白的特 异性识别。

在每个片层的顶端各有 一个突环毒素与受体的作用主要 是通过这些突环与受体蛋白识别、 并进一步不可逆结合的突环上氨 基酸组成和残基的带电性、侧链大 小及疏水性等对毒素与受体的专一 性结合都有影响，删除突环或改变 突环上残基的性质都会导致毒素与 受体结合能力的严重丧失 结构域II β-片层上的突环结构域Ⅱ在毒素-受体结合中的作用3 杀虫晶体蛋白的作用机理 结构域Ⅲ在毒素-受体结合中的作用 结构域Ⅲ是由两组反平行的β-折叠片层组成的三明治结构 ① 通过交换不同毒素的结构域Ⅲ发现,该结构域对毒素的杀虫专一性有一定影响② 结构域Ⅲ也参与了毒素与受体的结合 结构域Ⅲ与受体结合及离子通道活性的调节有关不同品系的Bt由于产生的Cry蛋白类型不同，不 仅杀虫谱不同，而且很可能拥有不同的作用方式总 之，Bt内毒素在进入昆虫中肠后，先是在碱性条件下 溶解，然后被活化为小分子多肽,再与中肠内膜上的 刷缘状膜小泡（BBMV）中特异受体结合，毒素分子插 入质膜形成一个微孔，阳离子和小分子渗入，这些微 孔因渗透肿胀而变大，最终细胞破裂昆虫中肠上皮 细胞死亡，肠壁受损，肠道内容物进入血淋巴，直接 造成血淋巴pH值上升可使昆虫麻痹死亡；毒性肽进入 血淋巴可使昆虫患毒血症死亡；活细胞或孢子进入血 腔可使昆虫患败血症死亡。

3 杀虫晶体蛋白的作用机理 二氢沉香呋喃类化合物：苦皮藤素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等可致粘虫：中肠柱状细胞的微绒毛排列不整齐，大量脱落 ；基膜内褶空间变大，排列紊乱；细胞质密度降低； 内质网极度扩张 ，囊泡化，核糖体脱落；线粒体嵴模 糊不清楚，双层膜不完整推测其机理为：此类化合 物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改 变，水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞肿 胀、失水、瓦解，最终死亡推测其机理为：此类化 合物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生 改变，水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞 肿胀、失水、瓦解，最终死亡 二、其他消化毒剂饥饿对照 处 理正常对照脱氧鬼臼毒素对菜青虫组织结构的影响浑浊溃烂状肠道内无食物残 渣，呈黄色透明鬼臼毒素类化合物 CK12h24h72h48h36h组织学观察结果：中肠围食膜逐渐消融，几乎完全消失对照试虫中肠饥饿试虫中肠处理试虫中肠CK中肠完好,厚度较均匀，细胞 间隙小，而处理中肠肠壁细胞逐 渐变得浑浊不连续，且中肠细胞 松散，细胞间隙拉大，中肠肠壁 细胞间的气泡明显增多这可能 是由于脱氧鬼臼毒素作用于试虫 的肠壁细胞，肠壁细胞被破坏， 肠壁细胞外液得以内渗，导致肠 壁细胞肿胀。

组织学观察结果处理中肠微绒毛对照中肠微绒毛组织学观察结果：丁布：可阻碍欧洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟幼虫的发育 ，使得幼虫体重降低，发育迟缓，蛹重降低，并出现畸 形蛹等，并对亚洲玉米螟幼虫具有较强的拒食作用丁 布是一种消化抑制剂，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的活性而影响食物的消化，进而影响昆虫的生长发育 丁布作用于玉米螟的中肠细胞，使肠壁细胞再生细胞大 量分裂，打破了固有的分裂周期，造成局部肿瘤，进而 细胞消融急剧增长的肿瘤细胞消耗大量的能量，而且 受损的肠壁细胞不再具备分泌消化酶进行消化和吸收营 养物质的功能，因而造成幼虫缺乏营养而死亡。