YAP和P14ARF基因表达及P14ARF基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相关性研究.pdf

温州医学院硕士学位论文Y A P 和P 1 4 孵基因表达及P 1 4 根9 基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相关性研究答辩委员会主席：邳歪刖塾援答辩委员会成员：篮筮狴塾援虞叠搓麴握论文答辩日期：2 0 1 3 年0 5 月2 6 日温州医学院硕士学位论文目录I Y l l 2 lU 3 lU19ll117lll1 4llll7lll l l o l l ．Y 2 3 9 7 4 7 0 ’1 中文摘要⋯．．．．．．⋯．⋯⋯．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．42 英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64 材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯115 结果．⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯2 26 分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 88 参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 39 附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 510 致谢，⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．．．．．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯3 61 l 综述．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．3 712 参考文献⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯．⋯4 913 文独创性声明、论文使用授权声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5 4温州医学院硕士学位论文Y A P 和P 14 胩‘基因表达及P 1 4 腑基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相关性研究中文摘要目的：探讨Y A P ( Y e s —a s s o c i a t e dp r o t e i n ) 基因与状腺乳头状癌( p a p i l l a r yt h y r o i dc a r c i n o m a ，P T C ) 发生发展的关系及其生物学意义，探讨甲状腺乳头状癌中用∥彬基因启动子甲基化及蛋白的表达及意义，分析Y A P 基因和P 1 4 基因在甲状腺乳头状癌中表达的相关性。

材料与方法：1 ．材料：选自台州学院附属台州市立医院肿瘤外科2 0 1 1 年2 月至2 0 1 1 年9 月期间的手术切除组织标本共4 0 例其中实验组甲状腺乳头状癌2 0 例，男性6 例，女性1 4 例，年龄2 3 —6 5 岁，平均4 5 ．3 岁，根据患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移情况分成哑组，其中肿瘤组中年龄≥4 5 岁1 5 例， 2 c m 的l l 例，肿瘤直径≤2 c m 的9 例：伴淋巴结转移4 例，无淋巴结转移1 6 例：对照组为随机选取的结节性甲状腺肿手术标本中相对正常的组织，男性9 例，女性l l 例，年龄2 6 - 5 7 岁，平均4 0 ．2 岁标本体积约5 x 5 m m 大小，其中1 ／2 于2 0m i n 内置于一8 0 C 冰箱中保存，用于甲基化特异性P C R 、实时定量P C R 及W e s t e r nb 1o t 检测：另1 ／2 置于1 0 ％福尔马林溶液中固定，用于免疫组织化学检测所有标本均经病理证实，且经病患同意；所有病例术前均未行放疗或者化疗2 ．方法2 ．1Q R T —P C R ( 实时定量P C R ) ：检测H P 基因m R N A 在甲状腺乳头状痛及对照组间的表达情况；检测P I ∥m R N A 在甲状腺癌组织、对照组中的表达情况，组间采用t 检验，P O ．0 5 )3 ．I I t O ；Y A P 蛋白在对照组中表达均呈强阳性，甲状腺乳头状癌组织中呈弱阳性，P 1 4 “”蛋白在对照组中表达均呈强阳性，甲状腺乳头状癌组织中呈弱阳性。

并且具有统计学意义( P 1 用B C A 法测蛋白浓度，根据蛋白质曲线计算电泳所需蛋白，配置1 0 ％浓缩胶和5 ％的分离胶，上样量每孔为5 0 u ．g ，标准蛋白M a r k e r为5 “l ，8 0 、1 2 0 v 电泳，恒压l O vl h 转膜至硝基纤维膜上，5 ％脱脂奶粉封闭2 h ，加入一抗3 m l ( Y A P 抗体浓度1 ：1 0 0 0 ) 4 ℃冰箱过夜，加入二抗体( H R P 标记的山羊抗兔I g G 抗体，浓度为l ：5 0 0 0 ) 室温静置1 ．5 h ，E C L 发光液滴加，暗室曝光显影定影，计算机软件分析蛋白灰度五、实验步骤1 ．R e a l —t i m eP C R 的流程1 ．1 R N A 抽提：1 ．1 ．1 取组织块5 0 一1 0 0m g 用液氮在研钵中研磨成粉木1 ．1 ．2 移入玻璃匀浆器加入l m lT r i z o l 抽打匀浆l 1 ．3 移入1 ．5 m t 新离心管用5 m l 针头抽打1 ．1 ．4 冰上孵育5 分钟1 ．I ，5 离心1 2 ，0 0 0 94 ℃5 分钟取上清液移入1 ．5 m l 新离心管1 ．1 ．6 加0 ．2m l 氯仿，震荡，冰上孵育5 分钟1 ．1 ．7 离心1 2 ，0 0 0 94 ℃1 0 分钟，取上层液相移入1 ．5 m l 新离心管1 ．1 ．8 加0 ．5m l 异丙醇，震荡，冰上孵育5 分钟1 ．1 ．9 离，01 2 ，0 0 0 94 ℃5 分钟，弃去上清液1 ．1 ．1 0 加入1m l7 5 ％乙醇，震荡1 ．1 ．Il 离心7 ，5 0 0 94 ℃5 分钟，弃去上清液1 ．1 ．1 2 室温下使之变透明1 ．1 ．1 3 加入D E P C 处理水3 0ul 溶解R N A ( 可保存在液氮或低温冰箱)1 ．1 ．1 4R N A 变性电泳观察1 8 s 、2 8 s 条带，分光光度计检测2 6 0 ／2 8 0 吸光度比值，计算R N A 浓度温州医学院硕士学位论文1 ．2c D N A 合成( 2 0ul 反应体系) ：取2ulR N A2ul1 0 ×R Tm i x ( 终浓度为l ×)2uld N T P 混合液( 终浓度为0 ．2 5m m o l ／Le a c hd N T P )2ulO l i g o —d T l 5 ( 终浓度为lum o ] ／L )1ulQ u a n tR e v e r s eT r a n s c r i p t a s eR N a s ef r e ed d H 2 0 至终体积为2 0ul3 7 ℃孵育6 0m i n 。

I ．3 反应步骤；1 ．3 ．19 5 ℃预变性2 m i n ，为第一步1 个循环1 ．3 ．29 5 ℃变性1 5 s ，6 5 ℃退火3 0 s ，6 8 ℃延伸6 0 s ，为第二步共4 0 个循环最后9 5 ℃1 5S ，降温至6 0 ℃1m i n ，然后按每i 5 s 上升0 ．3 ℃至9 5 ℃后，保持1 5 s 分别收集荧光信号，进行熔解曲线分析2 ．免疫组织化学操作步骤2 ．1 新取组织制作蜡块者需经1 0 ％甲醛溶液固定1 6 小时以上，石蜡包埋、切片4um 厚6 8 ℃烤片+ 3 0 m i n 2 ．2 石蜡切片脱蜡至水：经二甲苯1 、二甲苯2 、1 0 0 ％乙醇、1 0 0 ％乙醇、9 0 ％乙醇、9 0 ％乙醇、8 5 ％乙醇、8 0 ％乙醇、7 5 ％乙醇、7 5 ％乙醇分别浸泡1 5 m i n 、1 5 m i n 、1 0 m i n 、1 0 m i n 、5 m i n 、5 m i n 、3 m i r l 、3 m i n 、1 m in 、i m i n 2 ．3 滴加3 ％过氧化氢于组织上避光湿盒孵育l O m i n 2 ．4 P B S 缓冲液洗5 m i n ×3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) 。

2 ．5 将玻片插入染色架上，于0 ．I m m o ] ／L 枸橼酸缓冲液煮沸修复抗原15 m in 2 ．6 室温自然冷却2 0 m i n 以上，缓慢降至室温P B S 缓冲液洗5 m i n ×3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) ，平放于湿盒中2 ．7 玻片滴加3 ％B S A 或1 0 ％山羊血清封闭3 0 m i n ，倾去2 ．8 玻片滴加一抗，4 ℃过夜2 ．93 7 ℃复温4 5 m i n ，P B S 缓冲液沈5 m i n x3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) ，平放于湿盒中2 ．1 0 分别加入二抗，3 7 C 3 0 m i n ，P B S 缓冲液洗5 m i n ×3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) ，平放于湿盒中2 ．1 1 滴加预备好的D A B 工作液5 0 一1 0 0ul ，光镜下控制显色，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色2 ．1 2 苏木素复染5 m i n ，流水冲洗2 0 m in 2 ．1 3 各级酒精脱水( 以上酒精浓度，方向相反，时间同上) 、二甲苯透明5 m i n ×31 4温州医学院硕士学位论文次。

2 ．1 4 取出玻片，用中性树脂封片2 ．1 5 显微镜下判读结果3 ．w e s t e r n —b l o t 操作步骤3 ．1 蛋白质样品获得：机械或超声波室温匀浆0 ．5 一l m i n 然后4 C ，1 3 ，0 0 0 9 离心1 5 m i n 取上清液作为样品3 ．2 电泳：制备电泳凝胶，进行S D S —P A G E 3 ．3 转移：( 半干式转移)3 ．3 ．1 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5 m in X3 次3 ．3 ．2 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和N C 膜，浸入转膜缓冲液中1 0 m i n 3 ．3 ．3 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、2 4 层滤纸、N c 膜、凝胶、2 4 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、N C 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压5 0 0 9 重物，将碳板上多余的液体吸干接通电源，恒流l m A ／c m ，转移1 ．5 h 转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中5 0 s 后，在5 0 ％甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

3 ．4 免疫反应：3 ．4 ．1 用0 ．0 1 M P B S 洗膜，5 m i n ×3 次3 ．4 ．2 加入包被液，平稳摇动，室温2 h r 3 ．4 ．3 弃包被液，用O ．0 1 M P B S 洗膜，5 m i n ×3 次3 ．4 ．4 加入一抗( 按合适稀释比例用0 ．0 1 MP B S 稀释，液体必须覆盖膜的全部) ，4 C 放置1 2 h r 以上阴性对照，以I ％B S A 取代一抗，其余步骤与实验组相同3 ．4 ．5 弃～抗和I ％B S A ，用0 ．0 1 M P B S 分别洗膜，5 m i n ×4 次3 ．4 ．6 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗( 按合适稀释比例用O ．0 1 MP B S 稀释) ，平稳摇动，室温2 h r 3 ．4 ．7 弃二抗，用0 ．0 1 M P B S 洗膜，5 m i n ×4 次3 ．4 ．8 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应六、统计学处理应用S P S S l 2 ．0 0 统计软件包对数据进行处理，采用矿检验、T 检验对结果进行统计分析第二部分：P 1 4 胩‘基因表达及其启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相 关性研究温州医学院硕士学位论文一、研究对象：1 ．标本来源：选自台州学院附属台州市立医院肿瘤外科2 0 1 1 年2 月至2 0 1 1 年9月期间的手术切除组织标本。

对照组为随机选取的结节性甲状腺肿手术标本中相对正常的组织标本体积约5 X 5 m m 大小，其中l ／2 于2 0m i n 内置于一8 0 C 冰箱中保存，另1 ／2 置于1 0 ％福尔马林溶液中固定所有标本均经病理证实，且经病患同意；所有病例术前均未行放疗或者化疗2 ．临床资料：其中实验组甲状腺乳头状癌2 0 f f 0 ，男性6 例，女性1 4 f f 0 ，年龄2 3 、6 5岁，平。