JSRV-TM重组真核表达载体的构建及其在HepG2细胞株中的表达.pdf

全国兽医病理学、动物病理生理学学术会议论文集J S R V - T M 重组真核表达载体的构建及其在H e p G 2 细胞株中的表达C o n s t r u c t i o no fR e c o m b i n a n tV e c t o ro fj s R v —T MG e n ea n di t sE x p r e s s i o ni nH e p G 2C e l l s刘霄卉1 ，罗军荣1 ，一，斯日古楞1 ，周建华3 ，马学恩1( 1 内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特0 1 0 0 1 8 ；2 共同第一单位江西农业大学动科院，南昌3 3 0 0 4 5 ；3 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨1 5 0 0 0 1 )绵羊肺腺瘤病病毒( J a a g s i e k t er e t r o v i r u s ，J S R V ) 属于B 反转录病毒，为线性单股正链R N A ，全长7 ．4 k b ，编码相互重叠的g a g 、p r o 、p o l 、e n v 基因其中e n v 基因的o r f 编码跨膜蛋白( t r a n s m e m b r a n ep r o t e i n ，T M ) 和表面蛋白( s u r f a c ep r o t e i n ，S U ) 。

利用真核表达载体p C D N A 3 ．1 + ，建立在细胞内稳定表达t m 的H e p G 2 细胞系，为进一步研究T M 蛋白的结构与功能以及S P A 发病机理的研究奠定基础以p G E X 一4 T - 1 一T M 为模板，T M ．F ，T M ．R 为引物( 根据J S R V - N M 株e n v 基因序列，在e n v 基因的T M 区设计相应的引物，并引入E e o R I 和N o t I 酶切位点以及起始密码子和终止密码子，同时在下游引物的5 、末端融入H A 标记序列，使便于下一步检测目的基因的表达) 按常规方法进行P C R 扩增P C R 扩增产物经1 ．O ％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收纯化后与真核表达载体p c D N A 3 ．1 ( + ) ，均用E e o R I 和N o t I 限制性内切酶进行双酶切反应，l ％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的基因片段和经同样双酶切后的表达载体p c D N A 3 ．1 ( + ) 长片段；T 4D N A L i g a t i o n 连接靶基因及p C D N A 3 ．1 + 载体片段，C a C l 2 法转化E ．c o i lD H 5 a 菌株，涂布于含氨苄青霉素的L B 平板上，挑取2 0 个克隆，P C R 法及限制性内切酶分析鉴定，阳性克隆再送大连宝生物有限公司进行D N A 序列测定。

测序结果用C L U S T A L与目的序列进行对比分析阳性菌按O M E G A 去内毒素小量质粒提取试剂盒说明提取质粒，所得到的重组真核表达质粒命名为T M —H A ．p c D N A 3 ．1 “) ，用紫外可见分光光度计测定其浓度及纯度后贮存于．2 0 “ C 备用H e p G 2 细胞，采用含1 0 ％F B S 的D M E M 培养基( 含1 ％L ．谷氨酰胺、l ％双抗) ，在3 7 0 C ，5 ％C 0 2 培养箱内进行培养转染前一天，用胰酶消化并计数，将细胞接种于2 4 孔细胞培养板里，每孔加入5 0 0 u L 不含抗生素的正常生长D M E M 培养基，待密度为9 0 ％“ - ' 9 5 ％时，按脂质体转染说明书要求进行转染，在3 7 ℃5 0m I ．／I ，C 0 2 条件下培养8h 后，换用完全D M E M 培养基3 7 ℃5 0I I l 】乙／LC 0 2培养，4 8h 后改用终浓度4 0 0m g r t ．G 4 1 8 的完全D M E M 培筛选阳性细胞，阳性克隆再扩增培养以G 4 1 8 以3 0 0m e , n - ．维持，按常规进行传代培养；并设空载体p C D N A 3 ．1 + 转染作为对照。

将转染后的细胞，以A n t i —H AA n t i b o d y 为一抗，分别运用间接免疫荧光和W e s t e r n —B l o t 方法检测T M —H A —p c D N A 3 ．1 ( + ) 质粒的表达同时设立阴性对照：空载体转染的细胞；与空白对照：未转染T M —H A ．p c D N A 3 ．1 ( + ) 质粒的H e p G 2 细胞经P C R 获得了带有H A 标签的目的片段，琼脂糖凝胶电泳发现目的片段约7 0 0 b p ，与预期大小一致目的片段酶切后与p c D N A 3 ．1 ( + ) 载体连接，其产物重组表达质粒T M —H A —p c D N A 3 ．1 ( + ) 经P C R 及E c o R I 和N o t I 双酶切及测序结果，其插入序列经用C l u s t a l与目的序列进行对比分析，读码框架和插入方向完全正确T M —H A —p c D N A 3 ．1 ( + ) 转染H e p G 2 细胞后，经间接免疫荧光检测其表达结果：可看到绿色荧光细胞，且荧光都位于细胞膜，而空白对照和阴性对照均无荧光出现；W e s t e r n ．B l o t 方法检测重组质粒T M —H A —p c D N A 3 ．1 ( + ) 转染的H e p G 2 细胞裂解物在3 5 k D 处可见特异带，而空白对照和阴性对照没有阳性反应带。

J S R V 诱导肿瘤发生是通过它的囊膜蛋白( E N V ) 的致癌特质发生的，且主要是通过它的跨膜蛋白( T M ) 胞质尾区来实现的因此我们2 5 8全国兽医病理学、动物病理生理学学术会议论文集利用真核表达载体p C D N A 3 ．1 + ，已成功构建了含有T M 基因的p c D N A 3 ．1 ( + ) 一T M —H A 真核表达载体，并建立了在细胞内稳定表达此重组载体的H e p G 2 细胞系，该结果为进一步研究T M 蛋白的结构与功能以及S P A 发病机理的研究奠定了基础绵羊肺腺瘤病毒的斑点杂交技术检测D e t e c t i o no fJ a a g s i e k t eS h e e pR e t r o v i r u sb yD o tb l o th y b r i d i z a t i o n刘淑英，齐景伟，梁化春，徐萌杰( 内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特市0 1 0 0 1 8 )绵羊肺腺瘤病病毒( J a a g s i e k t es h e e pr e t r o v i r u s d S R V ) 是引起绵羊肺腺瘤病( S h e e pp u l m o n a r ya d e n o m a t o s i s ，S P A ) 的病原。

S P A 是世界动物卫生组织确定的B 类传染病本病1 8 2 5 年首次发现于南非，呈世界性分布，我国的内蒙古等养羊大区也有该病的发生和流行，S P A 的持续存在已严重威胁种羊的生产和养羊业的发展而如何特异性诊断该病是生产实践中急需解决的重要问题目前国内外科学家关于该病诊断方面的研究报告很混乱，因为到目前为止在S P A 病羊中未曾检测到循环抗体，不能用常规的免疫学方法进行诊断，同时引起该病的病原也未建立起体外培养体系，也不能用常规的传染病诊断方法进行诊断于是特异性检测该病的病原便成为诊断绵羊肺腺瘤病的必备条件本研究以经临床诊断和病理组织学检查诊断为自然感染S P A 的5 个病例，提取其外周血白细胞总D N A 和病肺组织总R N A 和D N A ，根据G e n B a n k 中已报道的e n J S R V 和e x J S R V 基因全序列，经过比对在它们的可变区内即g a g 、e n v ，U 3 基因区设计3 段特异性引物，以病肺组织总R N A 为模板，经R T - P C R 技术扩增出g a g ( 3 0 0 b p ) 、e n v ( 2 2 5 b p ) 、U 3 ( 1 7 6 b p ) 片断，纯化后用地高辛标记制备3 段特异性探针( 德国R o c h e 公司的探针标记试剂盒) ，灵敏度检测这3 段探针的最低检出量为5 一1 0 p g ，止。

以5 个病肺组织的D N A 和血液D N A 为被检品，分别与3 段特异性探针( 1 ．5 ¨L2 0 p m o V g L ) 在尼龙膜上进行斑点杂交，样本D N A 浓度约为1 0 0 p g ／蛐L ，结果显示在杂交膜上均可清晰看到圆形斑点出现，阴性对照未出现斑点，圆形斑点即为阳性杂交信号本试验结果验证了临床病理学的诊断结果，同时说明斑点杂交技术是用于诊断绵羊肺腺瘤病病毒的有效方法关键词：绵羊肺腺瘤病毒；斑点杂交技术；检测荧光原位杂交技术检测e n J S R V 在蒙古羊染色体上的分布D i s t r i b u t i o no fe n J S 甚NI nt h eM o n g o l i a nS h e e pc h r o m o s o m e sb yFlS H刘淑英，齐景伟，柴局，张文广( 内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特市0 1 0 0 1 8 )绵羊肺腺瘤病毒( j a a g s i e k t es h e e pr e t r o v i r u s ，J S R V ) 是引起绵羊肺腺瘤病( s h e e pp u l m o n a r ya d e n o r n a t o s i s ，S P A ) 的病原，S P A 是一种慢性、进行性、接触传染性的肺脏肿瘤性疾病，该病呈世界性分布，严重影响着世界范围内养羊业的发展。

但在所有已研究过的正常绵羊基因组内都含有1 5 - - -2 0 拷贝与J S R V 密切相关的内源性反转录病毒( e n J S R V ) 序列目前e n J S R V 的生物学作用还不十分清楚，但长期的演化理论表明，它们对机体的作用是有益方面大于有害方面本研究旨在通过确定e n J S R V 在健康蒙古羊基因组中的分布从而揭示其在S P A 发生过程中可能发挥的生物学作用。