米氏常数测定精.ppt

 实验十六实验十六  底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响                                            ——米氏常数的测定米氏常数的测定       目的要求目的要求               （（1））了解底物浓度对酶促反应的影响 （（2））掌握测定米氏常数Km的原理和方法实验原理实验原理 Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度Km的意义 Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同 Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大 测定Km值是酶学研究的一个重要方法 米氏方程： V[S] v = Km + [S ] v : 反应初速度 （微摩尔浓度变化/min) V : 最大反应速度 （微摩尔浓度变化/min) [S]：底物浓度 （mol/L) Km: 米氏常数 （mol/L) 此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度 之间的定量关系。

双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V 胰蛋白酶的性质胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解，产生自由氨基端氨基的测定氨基的测定 甲醛滴定法甲醛滴定法CH2NH2 HCHOCOO-CH2NHCH2OH HCHOCOO-CH2NH(CH2OH)2 COO-试剂和器材试剂和器材1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中自己配制）3. 0.25%酚酞乙醇溶液：4. 标准0.1M NaOH溶液5.胰蛋白酶溶液（已配好）试剂试剂器材器材：碱式滴定管             1．．取取50mL三三角角瓶瓶4个个，，加加入入5mL甲甲醛醛与与1滴滴酚酚酞酞，，以以0.1M标标准准NaOH滴滴定定至至微微红红色色，，4个个瓶瓶颜颜色色应应当当一一致致，，编编号。

号               2．．量量取取40g/L酪酪蛋蛋白白50mL，，加加入入一一150mL三三角角瓶瓶，，37℃℃保保温温10分分钟钟，，同同时时胰胰蛋蛋白白酶酶液液也也在在37℃℃保保温温10分分钟钟，，然然后后吸吸取取5mL酶酶液液加加到到酪酪蛋蛋白白液液中中同同时时计计时时！！））充充分分混混合合后后立立即即取取出出10mL反反应应液液（（定定为为0时时样样品品））加加入入一一含含甲甲醛醛的的小小三三角角瓶瓶中中（（1号号））加加10滴滴酚酚酞酞；；以以0.1M NaOH滴滴定定至至微微弱弱而而持持续续的的微微红红色色在在接接近近终终点点时时，，按按耗耗去去的的NaOHmL数数，，每每mL加加一一滴滴酚酚酞酞，，再再继继续续滴滴至至终终点点，，记记下下耗去的耗去的0.1M标准标准NaOH mL数 操作方法操作方法  3 3．在．在2 2分钟、分钟、4 4分钟、分钟、6 6分钟时，分别取出分钟时，分别取出1010mLmL反应反应 液，加入液，加入2 2号、号、3 3号、号、4 4号小三角瓶，同上操作，记下耗号小三角瓶，同上操作，记下耗 去去NaOH mLNaOH mL数。

数 以滴定度（即耗去的以滴定度（即耗去的NaOH mLNaOH mL数）对时间作图，数）对时间作图， 得一直线，其斜率即初速度为得一直线，其斜率即初速度为V V4040（（相对于相对于4040g/Lg/L 的酪蛋白浓度）的酪蛋白浓度） 然后分别量取然后分别量取3030g/Lg/L、、20g/L20g/L、、10g/L10g/L的酪蛋白溶的酪蛋白溶 液，重复上述操作，分别测出液，重复上述操作，分别测出V V3030、、V V2020、、V V1010 利用上述结果，以利用上述结果，以1/1/v v对对1/[1/[s]s]作图，即求出作图，即求出V V与与 K Km m值    （（1 1））实实验验表表明明，，反反应应速速度度只只在在最最初初一一段段时时间间内内保保持持恒恒定定，，随随着着反反应应时时间间的的延延长长，，酶酶促促反反应应速速度度逐逐渐渐下下降降原原因因有有多多种种，，如如底底物物浓浓度度降降低低，，产产物物浓浓度度增增加加而而对对酶酶产产生生抑抑制制作作用用并并加加速速逆逆反反应应的的进进行行，，酶酶在在一一定定pHpH及及温温度度下下部部分分失失活活等等。

因因此此，，研研究酶的活力以酶促反应的初速度为准究酶的活力以酶促反应的初速度为准 （（2 2））本本实实验验是是一一个个定定量量测测定定方方法法，，为为获获得得准准确确的的实实验验结结果果，，应应尽尽量量减减少少实实验验操操作作中中带带来来的的误误差差因因此此配配制制各各种种底底物物溶溶液液时时应应用用同同一一母母液液进进行行稀稀释释，，保保证证底底物物浓浓度度的的准准确确性性各各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间 注意事项注意事项 思考题思考题1.试述底物浓度对酶促反应速度的影响试述底物浓度对酶促反应速度的影响2.试述在何种条件下，测定酶的试述在何种条件下，测定酶的Km值可以作为鉴值可以作为鉴定酶的一种手段定酶的一种手段3米氏方程中的米氏方程中的Km值的实际应用是什么？值的实际应用是什么？4 本实验中的注意事项是什么？本实验中的注意事项是什么？。