第五届生物化学实验技能大赛实验报告.docx

華场煖紊夬摩第五届生物化学实验技能大赛实验报告制备蝇蛹壳聚糖工艺改良及其理化性质研究Improved Technology of Extract Chitosan from the Pupaand Study the Physical Chemistry Character原材料一蝇蛹制备蝇蛹壳聚糖工艺改良及其理化性质研究郭诗静，金昂丹，梁剑云 华南农业大学生命科学学院 （注：按姓名字母排序，不分先后）摘要：利用蝇蛹作为实验原料，通过改良后的酸法脫灰分，碱法脫蛋白质和脂肪制成甲壳 素后,通过热浓碱法脱乙酰基处理提取壳聚糖改良的工艺缩短了加工的时间， 但是也保证了质量提取过程中分别使用室温、加热、超声波三种不同的方法脱 蛋白，脱色方法也一改以往用有机溶剂的方法，改用双氧水；干燥恒重法测定其 水分，旋转黏度计测定其黏度，通过对成品进行这些理化性质的检测实验得沸水 的处理效果最好，超声细胞粉碎机对提取有一定点作用，双氧水的脱色效果不错, 可以进行进一步研究和推广关键词：蝇蛹 甲壳素 壳聚糖 水分 黏度 脱乙酰度044 - 1/a —1—1刖吕 1.1甲壳素与壳聚糖及其研究状况 041.2家蝇与提取工艺 051.3超声波 052可行性分析 063实验目的 064实验原理 065实验设备 075. 1仪器 075.2玻璃器具 076实验材料及试剂 076. 1原材料 076.2试剂 086.3试剂的配制 086.4材料的处理 087本实验的制作流程 118制作工艺比较 159各种理化性质方法比较 159.1用干燥恒重法测定其水分 159.2用旋转黏度计测定其黏度 169.3用酸碱滴定法测定游离氨基和脱乙酰度 1710 结论 1811注意事项 1812优点 18参考文献 19英文摘要 20附录 21感想 221 前言1.1甲壳素｛chitin)与壳聚糖(chitosan)及其研究状况壳聚糖(chitosan)在自然界中通常以甲壳素(M伽)的形式存在。

甲壳素乂名儿丁质，是一种天然 高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖儿丁质脱去分子中55%以上的乙酰呈就转变成壳聚糖， 甲壳素广泛存在于蟹壳、虾壳和节肢动物壳聚糖又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素，化学名称为(1,4)-2- 氨基・2・2■脱氧萄糖壳聚糖是白色或淡黄色半透明状固体，略有珍珠光泽，可溶于大多数稀 酸如盐酸、醋酸、苯甲酸等溶液，且溶于酸后，分子中氨基可与质子相结合而使自身帯正电荷但 壳聚糖不溶于水和碱溶液，也不溶于硫酸和磷酸在稀酸中，壳聚糖的主链也会缓慢水解，溶液的 黏度逐渐降低⑹甲壳素(M〃加)是存在于自然界中唯一一种带阳离子，能生物降解高分子的材料，广泛存在于昆 虫和甲壳类动物的硬壳和真菌的细胞壁中，是地球上蕴藏量最丰富的有机物之一也由于它可以与 人体中的有害物质相结合，并能排11!人体体外，使人体经常处于一种健康的生理状态，因而被誉为 “人类第六生命元素”⑴但中壳素溶解性能很差，直接使用的范围比较窄，而其脱乙酰产物一壳 聚糖(chitosan)则广为应用，其主要质暈指标是黏度及胺棊含暈壳聚糖经水解可生成壳低聚糖，壳 低聚糖具有较高溶解度，所以很容易被吸收利用分子量低于一万的壳低聚糖更展现出其独特的优 良生理活性和功能性质，可在人体肠道内活化增殖双歧杆菌，提高巨噬细胞吞噬能力，促进脾脏抗 体生长，抑制肿瘤细胞生长，降低血压、血糖、血脂，吸附胆固醇，在微环境中具有较强抑菌抗菌 作用和显著保湿吸湿能力等；较高聚合度壳低聚糖具有阻碍病原菌生长繁殖功能，能促进蛋白质合 成，活化植物细胞，从而促进植物快速生长等⑵。

同时，已经有不少的实例：纯度很高的甲壳素可 制成手术缝合线，经酶解后可被人体吸收，可生产手术隔离膜；对用來制造人造皮肤，作为创伤的 覆盖材料，由壳聚糖制成的隐性眼镜不但柔软，坚韧，而且吸水性好⑴壳聚糖在环保、医药、食 品，农业，日化等方面都有很强的应用前景，所以壳聚糠的产业化方向应该是一个比较重要的问题1963年，Budall根据X■衍射光谱得到的结果，提出了甲壳素存在三种晶型后，甲壳素和壳聚糖 的研究逐渐增多，20世纪50年代后已有专著出版自1977年在美国波士顿召开首次甲壳素和壳聚 糖的国际学术讨论会以来，国际社会己先后召开过9届国际甲壳素和壳聚糖学术会议，出版了数本 关于甲壳素和壳聚糖的专著一些发达国家争相投入大量资金对甲壳素和壳聚糖进行深入研究开发 口本政府拨出60亿日元启动经费，委托全国13所大学对甲壳素和壳聚糖进行系统研究开发，且在 基础研究及应用开发方面已取得巨大成就我国早在20世纪50年代就对甲壳素和壳聚糖的制备 及其应用进行了研究1958年，国内首先将乙酰化甲壳素应用于印染工业谢雅明和严峻分别于1983 年和1984年发表有关甲壳素化学的相关文章以來，甲壳素和壳聚糖的研究开始活跃起来。

目前世界甲壳素年产量仅为5000-10000吨，国际市场上每吨销售价约1700万美元〔,我国随 着生产的发展，从事制取甲壳质生产既可减少废弃物对环境污染又是企业和养殖专业户一条新的致 富之路1.2 家蝇与提取工艺苍蝇，是人们惯用的称呼，为科研而饲养的苍蝇只是蝇家族的一种，学名为“家蝇”苍蝇屈节 肢动物门昆虫纲双翅目,世界各地分布广泛，苍蝇在长期恶劣环境的生态压力下，通过产生抗菌物质 如溶菌酶、抗菌肤、凝集素、甲壳质等产生了特有的抗逆能力饲养的时候经过严格的无菌控制， 与日常见到的家蝇不同的是它不带有任何的病菌，被称为"工程蝇”或“资源蝇”而蝇蛹是苍蝇 的幼虫羽化后的外壳，从蝇蛹可提取人类所需要的抗菌肽、甲壳素、壳聚糖等有用物质自然界每年生物合成的甲壳素有数10亿吨之多，所以甲壳素是一种十分丰富的自然资源一 般工艺在以往壳聚糖制备工艺研究中，大多数以虾、蟹为原料，同时已经出现以微生物发酵提取⑷ 和以蝇蛹为原料提取以虾、蟹壳原料的供应受到地域和季节的影响，而且虾、蟹壳含钙量高，给 提取造成困难而以蝇蛹为原料制备壳聚糖甚少虾壳中含量为20%〜25%,蟹壳中含量为15%〜 18%⑷，甲壳素的提取量为4%,壳聚糖的提取量为3%[10],生产原料呈现相对不足和价格不稳定的状 态，而且从虾、蟹壳提取的甲壳素容易遭受海水污染以及甲壳素、壳聚糖容易吸附重金屈，因此很 难生产出高纯度的产品〔讥 另一方面，以微生物发酵生产壳聚糖，从经济角度讲，培养菌丝体要求 高、控制严格，造成提取的壳聚糖成本过高。

抗生素厂、柠檬酸厂发酵后的废菌丝体（国内仅废弃 青霉菌丝体每年就多达几十万吨）含水量高达85%,在高温条件下发酵产生难闻的气味，长期贮存 菌体自溶产生大量污水，造成严重的环境污染⑷但是如果选择家蝇进行科学的研究，有其主要的优点：家蝇的繁殖系数高，一对家蝇能产卵1000 个左右，4个月可生产2660亿，原料取之不尽，生活周期一般是7天左右就变成蛆，而且家蝇无休 眠现象，可在室内大批量饲养，养殖成本低，蝇蛹（蛆）碳酸含量低，色素少，所以成本低廉，工 艺简单，来源容易，容易保存，价格稳定，杂质少，纯度高，提取过程中对水、酸、碱消耗少；重 金属含量低；提取得甲壳素的分子量较虾、蟹的分子量小，溶解性提高，应用范围相应扩大在加 工工艺来说，比较简单，而且在不断的改良，而且处理用过的废碱液可以重新利用，已有实验证明 其效果同样的显著，不会对环境造成很大的污染和资源的浪费⑴1・3 超声波超声波是物质介质中的一种机械波超声波的生物学效应一般包括空化效应和热效应声化学 反应主要源于声空化一一液体中空腔的形成、振荡、生长、收缩至崩溃，及其引发的物理、化学变 化液体声空化的过程是集中声场能量并迅速释放的过程空化泡崩溃时极短时间在空化泡周围的 极小空间内产生高温高压，并伴有强烈的冲击波和高速射流，这为一般条件难以实现或不可能实现 的化学反应提供了一种新的非常特殊的物理环境，从而促使化学反应的进行［⑶。

超声波的应用日渐 广泛［⑷，对于实现工业化，如果能充分发挥其用处，将会有这重要的影响一般来说，超声波不会 破坏分子的内部结构使化学键断裂，但是可以增加分子的振动速率或者改变分子的构型，使其在反 应的时候出现更为适合反应进行的构象，推理是有助于反应的进行的，有探索价值本实验以蝇蛹为原料，采用稍加改进的酸、碱等提収工艺同时也采用超声处理的条件提収维持 天然特征的的壳聚糖，并对其理化性质进行了研究，从而讨论工艺的好与坏2可行性分析壳聚糖和甲壳素应用的广泛性，决定了壳聚糖生产工艺的实用性；原料来源容易解决而且比较低廉，有专门饲养的公司并己经联系好；加工工艺简单，试剂只需要碱和酸，仪器设备实验室已经齐备，玻璃器皿也为实验室常用器皿;使用过的废酸废碱可以循环利用，若不再使用，则进行中和反应便可以避免环境污染的问题；改良过的工艺，理论上具备速度和质量两方面的优点，(实际上也还没有找到资料有人尝试过), 所以这次的实操是比较有意义的；本次实验还准备尝试用超声的方法处理材料，如果有效果，理论上可以及降低加工的时间，所 以具有一定创新性；经过原材料的预处理，当天比赛操作的时间完全充足；操作安全，不会造成危险。

3实验目的通过蝇蛹提取出甲壳素，再经脱乙酰反应将甲壳素转化为壳聚糖，最后对壳聚糖灰分、水分、 脱乙酰度以及黏度进行分析，从而说明蝇蛹含有甲壳素和壳聚糖，且含量及质量都较为理想，改进 了加工工艺为工业化大规模生产提供理论基础4.实验原理甲壳素是一种天然高分子聚合物，通过B -D-(l-4)糖昔连接的2 一乙酸胺基一 2 一脱氧毗喃葡糖链节的线型聚合物，其结构如下：甲壳素有6卩，Y三种晶型，其中Q■甲壳素存在最丰富，也最稳定由于大分子之间极强的氢 键作用，导致其一般不溶于水，但化学性质非常稳定，因而应用有限，通常称英为几丁质要获取 甲壳素可以通过酸碱处理，脱去材料中的钙盐（俗称“灰分”）和蛋白质（和脂类）即可制得甲壳素壳聚糖又称脱乙駄甲壳素，一种阳离子型直链氨基多糖，学名聚（1—4）一2氨基脱氧一B—D—葡 萄糖，结构式如下：壳聚糖的脱乙酰度是壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分 数，也就是壳聚糖分子链上白由氨基的含量，是一项重要的技术指标之一从蝇蛹甲壳素提取的壳 聚糖灰分和水分比从虾蟹提取的要低，从而更有利于保存，而且纯度增高壳聚糖可溶于大多数稀 酸，如盐酸、乙酸、乳酸、苯甲酸、甲酸等酸溶液中，所以能用乙酸将其溶解。

测定的方法很多， 如酸碱滴定法、苦味酸法、胶体滴定法、银量滴定法、电位滴定法等本实验釆用最简单的酸碱滴 定法，该法不需特殊的仪器，且重复性好原理如下：壳聚糖的自由氨基呈碱性，可以与酸定量反 应生成盐，用碱来返滴定体系中剩余的酸量就可推算出自由氨基的百分含量因此，用甲基橙为指 示剂的酸碱滴定法是目前普遍使用的测定壳聚糖脱乙酰度的方法所以在检验方面，从用用干燥恒重法测定其水分，用旋转黏度计测定其黏度，用酸碱滴定法测 定游离氨基和含脱乙酰度5 实验设备5.1仪器分析天平、HWS24型电热恒温水浴锅、恒温干燥箱、真空干燥器、磁力搅拌器、旋转黏度计、 电炉、石棉网、1166025超声清洗机、抽滤器、干燥器、振荡器、JY92-2D超声波细胞粉碎机、Ph机5.2玻璃器具40目筛*1、碱式滴定管*1、瓷均堀钳*1、玻棒*3、称量瓶*3、500ml烧杯*3、1000ml烧杯*3、250ml烧杯*9、不锈钢煲*1、黑色胶手套*3对、小滤纸若干、PH试纸一沓、药勺*1、 大漏斗*3、试管夹*6,试管架*1、试管*12、小剪刀*1、蒸帼水瓶*3、锥形瓶*9、1000ml/500ml。