高脂环境下PM2.5对心血管内皮细胞毒性研究.docx

高脂环境下PM2.5对心血管内皮细胞毒性研究 摘要：目的 观察在高脂环境中，PM2.5诱导心血管内皮细胞（VECs）损伤的毒性作用，探讨其可能存在的作用机制，为PM2.5污染健康效应的相关研究给予相应的数据支持方法 采集我市城区大气中PM2.5，制成PM2.5样品液，取大鼠胸主动脉处的VECs，进行原代培养，将2.5 mmol/L triglyceride加入到DMEM培养液中，培养12 h后, 随机将细胞分为高脂对照组（2.5 mmol/L Triglyceride）、50 μg/mL PM2.5组、100 μg/mL PM2.5组、200 μg/mL PM2.5组和400 μg/mL PM2.5组，各组按相应剂量，加入PM2.5样品液处理24 h，同时设立阴性对照组检测VECs的存活率及凋亡情况、ROS、GSH-Px、CAT、SOD等指标结果 随着PM2.5染毒剂量的升高，VECs存活率显著下降，与高脂组相比，50 μg/mL PM2.5组，100 μg/mL PM2.5组、200 μg/mL PM2.5组和400 μg/mL PM2.5组细胞存活率，分别下降了3.1%，8.6%，16.5%，27.3%，PM2.5染毒组细胞凋亡率、ROS水平随之显著增加，细胞内GSH-Px、SOD、CAT水平显著降低（P<0.05）。

结论 在高脂环境下，PM2.5可以引发VECs氧化应激损伤，促进细胞凋亡，细胞内ROS状态的改变及抗氧化系统失衡，在PM2.5引发VECs凋亡过程中可能起重要作用关键词：PM2.5；高脂；心血管内皮细胞；氧化应激The Study on the toxicity of PM2.5 on cardiovascular endothelial cells in high-fat environmentJIA Li, YU Jia, DONG Hong-wei, WANG Meng-yuan, WANG Yue, SHANG Lei, GAO Hong* Department of Public Health, Harbin Medical University, Harbin, 150081Abstract: Objective The aim is to observe the toxic effect of PM2.5 on inducing cardiovascular endothelial cell injury under the high fat environment, and explore the possible mechanism, to provide corresponding data support on health effects of PM2.5 pollution. Methods PM2.5 were collected in the city. The cardiovascular endothelial cells in the thoracic aorta of rats were selected for primary culture. 2.5 mmol/L Triglyceride was added to serum-free medium for 12 hours. The cells treated with high fat were randomly pided into high fat control group, 50 μg/mL PM2.5group, 100 μg/mL PM2.5group, 200 μg/mL PM2.5group and 400 μg/mL PM2.5group. The cells in groups were treated with different concentrations of PM2.5 for 24 h and the negative control group was set up at the same time. The cell survival rate, apoptosis rate, ROS, GSH-px, CAT, and SOD were detected. Results The experimental results showed that the survival rate of vascular endothelial cells decreased significantly with the increase of PM2.5dose. Compared with the high fat control group, the cell survival rate of 50 μg/mL PM2.5group, 100 μg/mL PM2.5group, 200 μg/mL PM2.5group and 400 μg/mL PM2.5group decreased 3.1%, 8.6%, 16.5%, and 27.3%, respectively. Compared with the control group and the high fat group, the apoptosis rate and ROS level were increased, and the GSH-px, SOD and cat levels were decreased in 50 μg/mL PM2.5group, 100 μg/mL PM2.5group, 200 μg/mL PM2.5group and 400 μg/mL PM2.5group(P<0.05). Conclusion In high fat environment, PM2.5 can induce oxidative stress injury of cardiovascular endothelial cells, promote apoptosis, change of intracellular reactive oxygen species and imbalance of antioxidant system. PM2.5 plays an important role in inducing apoptosis of cardiovascular endothelial cells.Keywords: PM2.5; High-fat environment; Cardiovascular endothelial cells; Oxidative stress由化石燃料燃烧产生和机动车尾气排放等人为造成的颗粒物污染，已经成为环境污染的焦点问题之一，引发了社会各界的关注[1]。

危害更大且科学界关注更多的细颗粒物PM2.5因具有粒径小、表面积大、停留时间长、散播距离远的特性，如果没有恰当的防护措施，可以轻易进入人体呼吸道，甚至随血液在全身循环，从而对人体多个系统造成危害[2]研究表明，PM2.5可引起多个系统多种疾病的发生甚至死亡，存在密切的正相关关系[3]就循环系统而言，通过氧化损伤等途径，PM2.5可损害心血管内皮细胞，引发负面效应[4]并且，现如今，随着生活水平的提高，越来越多的人面临高脂血症（Hyperlipidemia）的风险作为一种明确的心血管系统的独立致病因素，高脂血症更是致使血管内皮细胞（Vascular endothelial cells, VECs）功能紊乱，从而引发动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）等疾病的元凶之一[5]关于PM2.5是否会影响高脂血症对心血管内皮细胞的损伤作用，目前还没明确本研究拟采用SD大鼠血管内皮细胞为研究对象，以高脂环境为媒介，观察PM2.5在高脂环境中，诱导血管内皮细胞损伤的情况，并对其可能的机制进行进一步探索，为PM 2.5污染健康效应的相关研究提供借鉴，也为环境决策制定者进一步制定和提出环境政策提供依据。

1材料与方法1.1 动物与试剂雄性Sprague Dawley大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心；细胞凋亡检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒购自上海谷研生物科技有限公司、甘油三酯、MTT、DMEM细胞培养基及其他试剂，购自哈尔滨赛拓生物科技有限公司1.2 实验分组与PM2.5染毒剂量使用大气采样仪（型号：QC-3，北京亚欧德鹏科技有限公司）采集大气PM2.5，用DMEM细胞培养液（上海钰博）配成储存液，临用前仍需超声震荡（型号：DL-480B，上海五相仪器仪表有限公司）5 min，细胞培养液稀释至所需浓度选取雄性8周龄SD大鼠适应性喂养一段时间后，经无菌操作取大鼠胸主动脉处的心血管内皮细胞，进行原代细胞培养，每3 d换一次液，备用在无血清培养液中加入2.5 mmol/L Triglyceride培养12 h，之后将经高脂处理过的细胞，随机分为阴性对照组（0 μg/mL PM2.5）、高脂对照组（2.5 mmol/L Triglyceride）、50 μg/mL PM2.5组、100 μg/mL PM2.5组、200 μg/mL PM2.5组和400 μg/mL PM2.5组，分别加入不同剂量的PM2.5样品液处理24 h，待测。

1.3指标测定1.3.1 MTT法检测细胞存活率制备单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔5103～1104个细胞，200 μL；放置于CO2孵箱中培养；加入PM2.5干预20 h后，避光每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续孵育4 h；终止培养，离心2000 rpm，15 min；弃上清，DMSO每孔150 μL，振荡10 min；设置570 nm波长，酶联免疫检测仪（型号：DG5033A，南昌普朗）上机测定1.3.2 流式细胞仪分析血管内皮细胞凋亡收集细胞，1000 r/min， 5min，去培养液，2ml 1PBS洗1次细胞沉淀以1Binding缓冲液，稀释至1106个/mL将100μL该溶液加入到5mL塑料管中，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染料，轻轻涡旋，暗处孵育15min，利用FACScan（Becton Dickinson）流式细胞仪，进行细胞凋亡的荧光检测1.3.3 检测胞内GSH-Px、CAT、SOD的检测加入PM2.5干预24 h后，收集细胞，采用相应的商品试剂盒，按照操作说明书，分别检测细胞内GSH-Px、SOD、CAT的活性1.3.4 ROS含量检测按照1:1000（v:v），用DMEM培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 μmol/L。

去除DMEM细胞培养液，加入DCFH-DA37℃孵育20 min，DMEM培养液洗涤细胞3次实时检测荧光强弱，发射波长使用525 nm，激发波长使用488 nm1.4数据处理与统计分析使用统计软件SPSS 20.0进行分析各组的指标数据结果用 表示行单因素方差分析（One-Way ANOVA）或非参数检验（Non-parametric test），P<0.05时，为差异具有显著性2 结 果2.1各组细胞存活率的比较细胞存活率采用MTT法检测，结果显示，高脂情况下，VECs存活率有所下降，但与对照组相比，差异无显著性；随着PM2.5染毒剂量的升高，VECs存活率显著下降，与高脂相比，50 μg/mL PM2.5组，100 μg/mL PM2.5组、200 μg/mL PM2.5。