公共场所卫生监测微生物检验技术PPT课件02.ppt

•（一）空气空气、微小气候（湿度、温度、风速）、采光、照明、噪声等室内环境的卫生检验、检测与评价；•（二）顾客用品用具客用品用具的卫生检验、检测与评价；•（三）游泳游泳场（（馆）和公共浴室水）和公共浴室水质卫生检验、检测与评价；•（四）公共公共场所所饮用水用水（包括：自备水、直饮水、二次供水）卫生检验、检测与评价；•（五）集中空集中空调通通风系系统的卫生检验、检测与评价Ø生活饮用水က《生活饮用水标准检验方法》》(GB/T 5750) (GB/T 5750) Ø宾馆微生物指标က《公共场所卫生标准检验方法》（GB/T 18204-2000）Ø游泳池水微生物指标ကက《公共场所卫生标准检验方法》（GB/T 18204-2000）Ø集中空调系统微生物指标ကက《公共场所集中空调通风系统卫生规范》（WS 394-2012）指标：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫、隐孢子虫￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿ 名称名称￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿单位位￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿限限值菌落总数ကကကကကCFU/mL 100 总大肠菌群ကကကကMPN/100mL或ကCFU/100mL 不得检出က耐热大肠菌群ကMPN/100mL或ကCFU/100mL 不得检出က大肠埃希氏菌ကMPN/100mL或ကCFU/100mL 不得检出က贾第鞭毛虫ကကကကကကကက个/10 L <1 隐孢子虫ကကကကကကကကကက个/10 L <1采样的原则: 1. 采集的水样，必须具有代表性代表性，能真实反映水质状况。

2.在实验室检测之前水样中微生物数量应保持不保持不变1.采样容器应采用洁净、无色、无毒的硬质玻璃（又称硼硅玻璃）样品瓶必须专瓶专用，切不可用实验室盛装过浓溶液的瓶作采样瓶通常我们使用500ml的高压灭菌的细口瓶采样2.容器及瓶塞、瓶盖容器及瓶塞、瓶盖应能能经受受灭菌的温度菌的温度3.容器洗容器洗涤：将容器用自来水和洗：将容器用自来水和洗涤剂洗洗涤，并用自来水彻底冲洗后，用10%盐酸溶酸溶液浸泡过夜，然后依次用自来水，蒸馏水洗净4. 容器容器灭菌：分干菌：分干热和高和高压蒸气蒸气灭菌两种干热灭菌要求160℃℃下下维持持2 h；高；高压蒸气蒸气灭菌要求121℃℃下下维持持15 min，高，高压蒸汽蒸汽灭菌菌后的容器如不立即使用，应于60℃℃将瓶内冷将瓶内冷凝水烘干灭菌后的容器应在2周内使用周内使用单独采样同一水源、同一时间采集几类检测指标的水样时，应先采先采集供微生物学指集供微生物学指标检测的水的水样采样时应直接采集，不得用水样涮洗已灭菌的采样瓶，并避免手指和其他物品对瓶口的沾污末梢水采集：采样前用酒精灯灼烧对水管口进行消毒，放水约5分分钟后采集水后采集水样约玻璃瓶的玻璃瓶的80%。

容容积整个整个过程要程要快，快，稳不要让水流水流过大，以免大，以免溅出，管口不要与瓶口接出，管口不要与瓶口接触，收集完触，收集完应马上将瓶塞旋上将瓶塞旋紧黑暗处，4℃，4h内内检测如有游离余氯应在采样瓶消毒前每125ml加硫代硫酸加硫代硫酸钠溶液溶液(10%)1.平皿平皿计数法数法本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定指在一定条件培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，1mL水样中所含菌落的总数生活饮用水•以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水充分混匀的水样，，注入注入灭菌平皿中，菌平皿中，倾注注约15 mL已融化并冷却到已融化并冷却到45℃℃左右左右的的营养养琼脂培养基，立即旋脂培养基，立即旋摇平皿，使水平皿，使水样与培养基充分与培养基充分混匀每次混匀每次检验时应做一平行接种，同做一平行接种，同时另用一个平皿只另用一个平皿只倾注注营养养琼脂培养基作脂培养基作为空白空白对照•待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±℃℃培养培养箱内培养箱内培养48 h，，进行菌落行菌落计数即为1mL水水样中的菌落中的菌落总数以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9 mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。

•吸取1:10的稀释液1 mL注入盛有9 mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1：100稀释液按同法依次稀释成1：1 000，1：10 000稀释液筹备用如此递增稀释一次，必须更换一支1 mL灭菌吸管用灭菌吸管取未稀释的水样和2个～3个适宜稀释度的水样1 mL，分别注入灭菌平皿内以下操作同生活饮用水的检验步骤菌落计数方法：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5 倍～倍～10 倍的放大倍的放大镜检查，以防，以防遗漏•两个平板若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数然后再以代表全皿菌落数然后再求求该稀稀释度的平均菌落数度的平均菌落数首先选择平均菌落数在30～～300之之间者者进行行计算，若只有算，若只有一个稀一个稀释度的平均菌落数符合此范度的平均菌落数符合此范围时,则将将该菌落数乘以菌落数乘以稀稀释倍数倍数报告之若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～～300之之间，，则视二者之比二者之比值来决定，若其比来决定，若其比值小于小于2应报告两者的平均告两者的平均效。

若大于或等于效若大于或等于2则报告其中稀告其中稀释度度较小的菌落小的菌落总数若所有稀释度的平均菌落数均大于300，，则应按稀按稀释度最度最高的平均菌落数乘以稀高的平均菌落数乘以稀释倍数倍数报告之若所有稀释度的平均菌落数均小于30，，则应以按稀以按稀释度最低度最低的平均菌落数乘以稀的平均菌落数乘以稀释倍数倍数报告之•若所有稀释度的平均菌落数均不在30～～300之之间，，则应以最以最接近接近30或或300的平均菌落数乘以稀的平均菌落数乘以稀释倍数倍数报告之•若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之如果所有平板上都菌落密布，不要用““多不可多不可计””报告，而告，而应在稀在稀释度最大的平板上，任意数其中度最大的平板上，任意数其中2个平板个平板1cm2中的中的菌落数，除菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6 ，再乘其稀，再乘其稀释倍数作倍数作报告菌落计数的报告：菌落数在100以内以内时按按实有数有数报告，大告，大于于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法，以四舍五入方法计算，算，为了了缩短数字后面的零数也可短数字后面的零数也可用用10的指数来表示（的指数来表示（见表表1“报告方式告方式””栏）。

定义：一群在36℃条件下培养24～48小时能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌总大肠菌群是卫生学上的概念，不是细菌分类学概念，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致主要包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等的细菌总大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在人、畜粪便对外界环境的污染是总大肠菌群在自然界存在的主要原因但它也来自植物的土壤，它所包括的微生物在地面水中也可繁殖粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以总大肠菌群其他型别较多本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定总大肠菌群检测比较简单，所以被广泛用做水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标也是评价生活饮用水卫生质量的重要指标之一将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36 ℃℃±l 培养箱内培养培养箱内培养18h～～24h，，观察菌落形察菌落形态，挑取符合下，挑取符合下列特征的菌落作革列特征的菌落作革兰氏染色、氏染色、镜检和和证实试验•深紫黑色、具有金属光泽的菌落；•紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；•淡紫红色、中心较深的菌落。

根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（（most probable number，最可能数），最可能数）检索表，索表，报告每告每1 00 mL水水样中的中的总大大肠菌群最可菌群最可能数能数(MPN)值•稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数•如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出（注意稀释度）定义：在44.5℃培养24h~48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌是大肠菌群的一个亚群，主要是埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属它很少在地面水中繁殖，且仅来源于人和温血动物的粪便，因此其卫生学意义更大，检出之表明饮水已被粪便污染，有可能有肠道致病菌和寄生虫等病原体的危险定义：大肠埃希氏菌广泛存在于是人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气、IMViC生化试验为+ + --或-+ --大肠埃希氏菌主要是用于指示水源近期受到粪便污染က该指标与粪便污染的相关性好多管发酵法总大肠菌群多管发酵法初发酵检测阳性管，用接种环挑一环到EC-MUG管中，管中，℃℃培养培养24h±2h，用，用366nm紫外灯照紫外灯照摄，，产生生兰色色荧光者光者为阳性阳性大肠埃希氏菌产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解四甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG ）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠埃希氏菌。

定性试验、定量试验（10管法、51孔定量盘法）培养基：EC-MUG黄色有黄色有蓝色色荧光者光者为阳性阳性水水样不不变黄有黄有蓝色色荧光者不属于阳性光者不属于阳性公共场所空气细菌总数测定(GB/T 18204.1-2000)茶具、毛巾、床上卧具等公共用品的细菌总数和大肠菌群ကn撞击法：将集菌的营养琼脂平板置撞击法：将集菌的营养琼脂平板置36±1℃℃培养培养48h，计数菌落数计数菌落数n自然沉降法：将已采样平板置自然沉降法：将已采样平板置36±1℃℃培养培养48h，计数每块平板上菌落数，求出全部采，计数每块平板上菌落数，求出全部采样点的平均菌落数样点的平均菌落数n撞击法撞击法 计算公式：细菌总数计算公式：细菌总数=平皿菌落数平皿菌落数/（采样器流量（采样器流量*采样时间）采样时间） 结果单位：结果单位： cfu/m3 n自然沉降法自然沉降法 计算公式：细菌总数计算公式：细菌总数=平均每皿菌落数平均每皿菌落数 结果单位：结果单位：cfu/皿皿采采样：：用灭菌生理盐水湿润棉拭子，在茶具与口唇接触的内外缘涂抹50cm2，既高，既高处一圈用灭菌剪菌剪刀剪去棉刀剪去棉签手接触的部分，将棉拭子放入手接触的部分，将棉拭子放入10mL生理生理盐水内，水内，4h内送内送检。

此液作为1:10n将采来的将采来的1:10样品涂抹液（棉拭子涂抹）充分混样品涂抹液（棉拭子涂抹）充分混匀，再取匀，再取1:10样液样液1mL于于9mL的的NS中充分混匀为中充分混匀为1:100样液两稀释度各吸样液于两个平皿中，每样液两稀释度各吸样液于两个平皿中，每皿皿1mL最后注入营养琼脂，置最后注入营养琼脂，置36±1℃℃培养培养48h计数菌落数计数菌落数n同时做空白对照同时做空白对照n计算公式：计算公式： 细菌总数细菌总数=平均菌落数平均菌落数*稀释倍数稀释倍数/50n单位：单位：cfu/cm2发酵法：取测定茶具菌落总数剩余样品，倒入双料乳糖胆盐发酵溶液中，置37℃℃培养箱内培养培养箱内培养24 h后后进行行观察阴性报告阳性进一步接种一步接种EMB、乳糖、乳糖发酵管纸片法：用灭菌生理盐水湿润5 cm×5 cm大大肠菌群快速菌群快速检测纸片两片两张，分，分别粘粘贴在茶具内、外在茶具内、外缘口唇接触口唇接触处，，约30 S后后取下，置于无菌塑料袋内置取下，置于无菌塑料袋内置37℃℃培养箱内培养培养箱内培养24 h后后进行行观察结果果报告告推测性试验：将测定细菌总数剩余的检样倒入双料乳糖胆盐发酵液中，置36±1℃培养24h观察结果。

证实试验：自推测性试验阳性管中取一接种环培养液，接种EMB平板上，置36±1℃培养24h观察结果挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，36±1℃培养24h观察结果将已采样的大肠菌群测定纸片置36±1℃培养16～18h观察结果结果判定：若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性§涂抹法：涂抹法：25 c㎡㎡(5 cm ×5 cm)面积范围面积范围;床单、被单在上下床单、被单在上下两部各两部各25 c㎡面积范围内有顺序地来回涂抹，将棉拭子放人㎡面积范围内有顺序地来回涂抹，将棉拭子放人10 mL生理盐水内，生理盐水内，4h内送检内送检n戳印法戳印法n将采来的将采来的1:10样品涂抹液（棉拭子涂抹）充分混样品涂抹液（棉拭子涂抹）充分混匀，再取匀，再取1:10样液样液1mL于于9mL的的NS中充分混匀为中充分混匀为1:100样液两稀释度各吸样液于两个平皿中，每样液两稀释度各吸样液于两个平皿中，每皿皿1mL最后注入营养琼脂，置最后注入营养琼脂，置36℃℃培养培养48h计计数菌落数数菌落数n同时做空白对照同时做空白对照n计算公式：计算公式： 细菌总数细菌总数=平均菌落数平均菌落数*稀释倍数稀释倍数/2n单位：单位：cfu/25cm2发酵法纸片法涂抹法：用测定细菌总数时采集的样品，无需重采。

纸片法：用灭菌生理盐水湿润5 cm ×5 cm大大肠菌群菌群快速快速测定定纸片两片两张，分，分别粘粘贴在毛巾、床上卧具在毛巾、床上卧具规定部位和面定部位和面积范范围内，内，约30 s后取下，置于无菌塑料后取下，置于无菌塑料袋内推测性试验：将测定细菌总数剩余的检样倒入双料乳糖胆盐发酵液中，置36±1℃培养24h观察结果证实试验：自推测性试验阳性管中取一接种环培养液，接种EMB平板上，置36±1℃培养24h观察结果挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，36±1℃培养24h观察结果将已采样的大肠菌群测定纸片置36±1℃培养16～18h观察结果结果判定：若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性指在BaurdParker培养基或血平板培养基上生长良好，分解甘露醇产酸；血浆凝固酶阳性的革兰氏阳性葡萄球菌•菌落直径为2 ～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈取大肠菌群检测后剩余的5 mL待待检样品，放入品，放入45 mL7.5%氯化化钠肉肉汤或胰酪或胰酪胨大豆肉大豆肉汤培养基中，培养基中，36℃℃±1℃℃增菌增菌24 h。

分离于P-k培养基（或用血平皿），培养基（或用血平皿），36℃℃±1℃℃24 h挑取典型菌落作涂片挑取典型菌落作涂片镜检、甘露醇、甘露醇发酵酵试验和血和血浆凝固凝固酶试验指在一定条件培养后，50cm2面积检样中所含有的霉菌和酵母菌落数霉菌和酵母菌主要作为判定被检样品被霉菌和酵母菌污染程度的标志，以便对被检样进行卫生学评价时提供依据将无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水，在每只拖鞋鞋面与脚趾接触处5 cm×5 cm面积上，有顺序地均匀涂抹3次（一双拖鞋为一份样品）后，用灭菌剪刀将棉拭子手执部分剪断，将棉拭子放入10 mL装有玻璃珠的无菌盐水管中•将盛有棉拭子的盐水管在手心用力振荡100次，再用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开此液为1:10稀释液•依次做10倍递增稀释，根据样品的污染情况，选择3个合适的稀释度•将溶化并冷却至45℃左右的培养基注入灭菌的平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃温箱中，3天后开始观察，共培养观察一周Ø细菌总数Ø大肠菌群က取样液到2只平皿中，每皿1mL；另取样液1mL到9mL灭菌生理盐水中作1：10稀释，取稀释液到2只平皿中，每皿1mL。

最后注入营养琼脂置36℃培养48h计数菌落数同时做空白对照n计算公式：计算公式： 细菌总数细菌总数=平均菌落数平均菌落数*稀释倍数稀释倍数n单位：单位：cfu/mL发酵法滤膜法推测性试验：在2个装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管内各加入100mL水样，在10支装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管内各加入10mL水样，36℃培养24h观察结果证实试验：自推测性试验阳性管中取一接种环培养液，接种EMB平板上，置36℃培养24h观察结果挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，36℃培养24h观察结果水样过滤，滤膜截留细菌面向上，贴紧乳糖琼脂分离培养基，置36℃培养24h观察结果典型菌落染色镜检挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，36℃培养24h观察结果Ø送风中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌Ø风管内表面细菌总数、真菌总数Ø冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌送风中细菌总数：集中空调通风系统送风中通过六级筛孔空气撞击式采样器采集的样品，计数在营养琼脂培养基上经35~37℃、48h培养所形成的菌落数以每立方米空气中菌落形成单位（CFU/m3）报告。

送风中真菌总数：集中空调通风系统送风中通过六级筛孔空气撞击式采样器采集的样品，计数在沙氏琼脂培养基上经28℃、5d培养所形成的菌落数以每立方米空气中菌落形成单位（CFU/m3）报告送风中β-溶血性链球菌：集中空调通风系统送风中通过六级筛孔空气撞击式采样器采集的样品，计数在血琼脂培养基上经35~37℃、24h~48h培养所形成的典型菌落数以每立方米空气中菌落形成单位（CFU/m3）报告风管内表面微生物检测主要包括细菌总数和真菌总数采样面积：每一点采样面积应为50cm2က采样方法：空调风管内表面积尘较多时用刮拭法采样，积尘较少不适宜刮拭法采样时用擦拭法采样整个采样过程应无菌操作为避免人工采样对采样环境的影响，宜采用机器人采样က刮拭法：将采集的积尘样品无菌操作称取1g，加入到0.01% Tween-80水溶液中，做10倍梯级稀释，取适宜稀释度1mL倾注法接种平皿擦拭法：将擦拭物无菌操作加入到0.01% Tween-80水溶液中，做10倍梯级稀释，取适宜稀释度1mL倾注法接种平皿风管内表面细菌总数：向接种好样液的平皿倾注营养琼脂培养基，经35~37℃、48h培养，计数菌落数。

以每平方厘米表面积中菌落形成单位（CFU/cm2）报告风管内表面真菌总数：向接种好样液的平皿倾注沙氏琼脂培养基，经28℃、5d培养，计数菌落数以每平方厘米表面积中菌落形成单位（CFU/cm2）报告用培养法定性测定集中空调系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中的嗜肺军团菌，其他洗浴水、温泉水、景观水等样品中的嗜肺军团菌测定可参照执行嗜肺军团菌：样品经培养在GVPC琼脂平板上生成典型菌落，并在BCYE琼脂上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCY琼脂平板不生长，进一步经生化试验和血清学试验鉴定确认的菌落采样位置：冷却水距离塔壁20cm，液面下10cm；冷凝水排水管、冷凝盘处采样量500mL一、样品沉淀、离心、过滤二、样品处理：1、样品的热处理，1mL洗脱样品，50℃水浴30min2、样品的酸处理，5mL洗脱样品调pH值，混匀5min三、样品的接种、培养：GVPC平板，35-37℃，2.5%CO2培养10天第三天，阳性标本能够出现白色、灰色，整齐，表面光滑，成典型毛玻璃状四、鉴定：ကကကBCYE培养：生长；BCY培养：未生长满足上述菌落进行生化及血清学鉴定氧化酶-/(+),硝酸盐还原-，尿素-，明胶液化+，水解马尿酸。

用嗜肺军团菌诊断血清进行分型谢￿￿￿￿谢！！。