蛋白质分子设计ppt课件.ppt

第一章绪论第二章蛋白质构造根底第三章蛋白质分子设计第四章蛋白质的修饰和表达第五章蛋白质理化性质的分析和鉴定第六章蛋白质工程的实践运用蛋白质工程蛋白质分子设计蛋白质分子设计基于天然蛋白质构造的分子设计基于天然蛋白质构造的分子设计蛋白质设计原理蛋白质设计原理蛋白质设计中构造与功能关系的研蛋白质设计中构造与功能关系的研讨讨天然蛋白质剪接天然蛋白质剪接全新蛋白质设计全新蛋白质设计蛋白质的从头设计蛋白质的从头设计蛋白质设计的目的蛋白质设计的目的•为蛋白质工程提供指点性信息•探求蛋白质的折叠机理 简单蛋白质建筑或骨架的从头设计是研讨蛋白质相互作用的类型及本质的很好途径，为处理蛋白质折叠问题寻觅定性和定量的规律蛋白质设计存在问题蛋白质设计存在问题•设计的蛋白质与天然蛋白质相比缺乏构造的独特性极明显的功能优越性•设计的蛋白质有正确的形貌、显著的二级构造及合理的热力学稳定性，但三级构造确实定性较差按照改造部位的多寡分为三类：第一类为“小改〞，可经过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改〞，对来源于不同蛋白的构造域进展拼接组装；第三类为“大改〞，即完全从头设计全新的蛋白质〔de novo design〕 蛋白质分子设计的分类蛋白质的分子设计蛋白质的分子设计 可分为两个层次在知立体构造根底上所进展的直接将立体构造信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计任务在未知立体构造的情形下借助于一级构造的序列信息及生物化学性质所进展的分子设计任务 蛋白质分子设计程序蛋白质分子设计程序•蛋白质分子设计程序：各种蛋白质构造预测和分子设计程序•按照蛋白质分子设计的层次分为序列分析、二级构造预测、同源蛋白质构造预测、蛋白质突变体构造预测、蛋白质的性能预测和蛋白质分子设计六个部分 计算机模拟 基因构建突变蛋白质产品突变蛋白质产品功能分析功能分析蛋白蛋白质设计循循环第一节第一节 基于天然蛋白质结基于天然蛋白质结 构的分子设计构的分子设计 蛋蛋白白质质分分子子设设计计流流程程图图天然蛋白质天然蛋白质蛋白质晶体学蛋白质晶体学新蛋白质新蛋白质蛋白质三维构造蛋白质三维构造构造与功能关系构造与功能关系蛋白质突变体设计及构造预测蛋白质突变体设计及构造预测几何优化及蛋白质动力学研讨几何优化及蛋白质动力学研讨构造分析与原先的构造比较构造分析与原先的构造比较蛋白质合成定位突变蛋白质合成定位突变分别、纯化及表征分别、纯化及表征蛋白质构造预测蛋白质构造预测从数从数据库据库输入输入蛋白质分子设计大致蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面涉及的几个重要方面•蛋白质来源：真菌、细胞、动物蛋白质和植物蛋白质•挑选以及纯化蛋白质需求测定它们的序列、三维构造、稳定性、催化活性等蛋白质三维构造的判别蛋白质三维构造的判别 目前目前PDB(Protein Data Bank)PDB(Protein Data Bank)已搜集数以万计个已搜集数以万计个蛋白质晶体构造，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质晶体构造，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维构造的数目大蛋白质三维构造的数目大100100倍。

倍1 1、对于知三维构造的蛋白质：根据、对于知三维构造的蛋白质：根据PDBPDB中三维构造中三维构造对蛋白质进展设计对蛋白质进展设计2 2、对于位置三维构造的蛋白质：假设、对于位置三维构造的蛋白质：假设PDBPDB中没有收中没有收录又未见文献报道，我们需求经过蛋白质录又未见文献报道，我们需求经过蛋白质X X射线晶射线晶体学及体学及NMRNMR方法测定蛋白质的三维构造，或者经过方法测定蛋白质的三维构造，或者经过构造预测的方法构建该蛋白质三维构造模型构造预测的方法构建该蛋白质三维构造模型•计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置建立蛋白质三维构造模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的构造与功能对蛋白质工程是至关重要的 •专注性突变产物是蛋白质设计成败的关键一些新技术，如PCR及自动化技术的开展使各种类型的基因工程变得快速、容易  二、蛋白质设计原理二、蛋白质设计原理 ①①内核假内核假设设所谓谓内核是指蛋白内核是指蛋白质质在在进进化中保守的化中保守的内部区域在大多数情况，内核由内部区域在大多数情况，内核由氢键衔氢键衔接的二接的二级级构造构造单单元元组组成成 ②②一切蛋白一切蛋白质质内部都是密堆内部都是密堆积积( (很少有空穴大到可以很少有空穴大到可以结结合一个水分子或惰性气体合一个水分子或惰性气体) )，并且没有重叠。

并且没有重叠③③一切内部的一切内部的氢键氢键都是最大都是最大满满足的足的( (主主链链及及侧链侧链) )④④ 疏水及疏水及亲亲水基水基团团需求合理地分布在溶需求合理地分布在溶剂剂可及外表可及外表及不可及外表及不可及外表⑤⑤ 在金属蛋白中，配位残基的交在金属蛋白中，配位残基的交换换要要满满足金属配位足金属配位几何，符合正确的几何，符合正确的键长键长、、键键角及整体的几何角及整体的几何⑥⑥ 对对于金属蛋白，大部分配基含有多于一个于金属蛋白，大部分配基含有多于一个 与金属与金属作用或构成作用或构成氢键氢键的基的基团团其他构成其他构成围绕围绕金属中心金属中心的的氢键氢键网网络络，，这这涉及与蛋白涉及与蛋白质质主主链链、、侧链侧链或水分或水分子的相互作用子的相互作用⑦⑦ 最最优优的氨基酸的氨基酸侧链侧链几何几何陈陈列列 ⑧⑧ 构造及功能的构造及功能的专专注性构成独特的构造，独特的注性构成独特的构造，独特的分子分子间间相互作用是生物相互作用及反响的相互作用是生物相互作用及反响的标标志志蛋白质设计的目的及处理方法 设计目的处理方法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥，添加内氢键数目，改善内疏水堆积，添加外表盐桥把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu，把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代外表羧基交换外表荷电基团His、Cys以及Tyr的置换，内离子对的置换专注性的改动，添加逆转数(turnover number)，改动酸碱度蛋白质突变体设计步骤蛋白质突变体设计步骤1〕以蛋白质的三维构造为根底，利用计算机模拟技术确定突变位点及交换的氨基酸2〕利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质构造3〕预测的构造与原始的蛋白质构造比较，利用蛋白质构造-功能或功能-稳定性相关知识及实际计算预测新蛋白质能够具有的性质留意问题留意问题A 应确定蛋白质折叠敏感的区域，包括带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区等B 应确定对功能非常重要的位置C 调查剩余位置对所希望改动的影响D 当进展互换或插入/删除残基是应思索他们对构造特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等三、蛋白质设计中的构造三、蛋白质设计中的构造－功能关系研讨－功能关系研讨定位突变在蛋白质构造与功能关系研讨中的作用定位突变在蛋白质构造与功能关系研讨中的作用定位突变在蛋白质构造与功能关系研讨中的作用定位突变在蛋白质构造与功能关系研讨中的作用突变蛋白质构象的探测突变蛋白质构象的探测突变蛋白质构象的探测突变蛋白质构象的探测定位突变种类定位突变种类•插入一个或多个氨基酸残基•删除一个或多个氨基酸残基•交换或取代一个或多个氨基酸残基•最大量的定位突变是在体外利用重• 组DNA技术或PCR方法突变蛋白质构造的评价突变蛋白质构造的评价•溶解性•热力学分析•Ｘ射线晶体学及ＮＭＲ谱•园二色散方法•单克隆抗体探测构象变化蛋白质中功能残基的鉴定蛋白质中功能残基的鉴定1．根据知构造信息确定功能残基2．突变实验方法鉴定功能残基 随机突变和删除分析及衔接片断扫描突变3．利用蛋白质同源性鉴定功能残基天然蛋白质的剪裁天然蛋白质的剪裁•分子剪裁：指在对天然蛋白质的改造中交换1个肽段或1个构造域•运用：抗体分子的改造；Rop构造与功能的容忍度构造与功能的容忍度• • 蛋白质构造及功能对残基的交换有一定的容忍度，即构造蛋白质构造及功能对残基的交换有一定的容忍度，即构造与功能关系有一定的稳健度与功能关系有一定的稳健度• •FershtFersht等交换了等交换了BarnaseBarnase的一切内核残基。

结果阐明的一切内核残基结果阐明2323％％的突变体保管了酶的活性的突变体保管了酶的活性• •MathewsMathews及其协作者在溶菌酶内核中交换多至及其协作者在溶菌酶内核中交换多至1010个残基实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠• •这些结果阐明不同的氨基序列具有相近的设计的构造这些结果阐明不同的氨基序列具有相近的设计的构造第二节第二节 全新蛋白质设计全新蛋白质设计•特征：• 全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程，合成具有特异构造与功能的新蛋白质根据所希望的构造及功能设计蛋白• 质或多肽的氨基酸序列蛋白质的全新设计蛋白质的全新设计•蛋白质构造的从头设计蛋白质构造的从头设计•蛋白质功能的从头设计蛋白质功能的从头设计•获得的进展：血红素结合蛋白、获得的进展：血红素结合蛋白、• 氧化复原活性蛋白质、氧化复原活性蛋白质、• DNA DNA结合蛋白结合蛋白• 基于蛋白质的高分子资基于蛋白质的高分子资料料•中心问题：设计一个具有稳定及独特的三维构造中心问题：设计一个具有稳定及独特的三维构造• 的序列的序列 •抑制的妨碍：线性聚合链的构象熵抑制的妨碍：线性聚合链的构象熵•采取的战略：采取的战略：• 1 1〕使相互作用的强度与数目到达〕使相互作用的强度与数目到达• 最大〔实际根底：分析知构造最大〔实际根底：分析知构造 • 的天然蛋白质中的二级构造单元〕的天然蛋白质中的二级构造单元〕• 2 2〕经过共价交叉衔接减小折叠的构象〕经过共价交叉衔接减小折叠的构象熵熵一、蛋白质构造的从头设计一、蛋白质构造的从头设计１．二１．二１．二１．二级级构造模构造模构造模构造模块单块单元的自元的自元的自元的自组组装：装：装：装：优优点：点：点：点：设计设计或合成都比或合成都比或合成都比或合成都比较简单较简单缺陷：蛋白缺陷：蛋白缺陷：蛋白缺陷：蛋白质质的的的的稳稳定性〔定性〔定性〔定性〔熵较熵较大，依大，依大，依大，依赖浓赖浓度〕度〕度〕度〕 构造的构造的构造的构造的简单简单反复反复反复反复α α螺旋螺旋螺旋螺旋设计设计运用的运用的运用的运用的战战略〔略〔略〔略〔p67p67〕：〕：〕：〕：1 1〕运用大的构成螺旋〕运用大的构成螺旋〕运用大的构成螺旋〕运用大的构成螺旋倾倾向性的残基，如亮氨酸、谷氨酸或向性的残基，如亮氨酸、谷氨酸或向性的残基，如亮氨酸、谷氨酸或向性的残基，如亮氨酸、谷氨酸或赖赖氨酸等氨酸等氨酸等氨酸等2 2〕运用适宜的集〕运用适宜的集〕运用适宜的集〕运用适宜的集团团去除端基去除端基去除端基去除端基电电荷，防止与螺旋偶极不适宜荷，防止与螺旋偶极不适宜荷，防止与螺旋偶极不适宜荷，防止与螺旋偶极不适宜的的的的电电荷相互作用荷相互作用荷相互作用荷相互作用3 3〕运用极化或荷〕运用极化或荷〕运用极化或荷〕运用极化或荷电电氨基酸引入氨基酸引入氨基酸引入氨基酸引入稳稳定的定的定的定的氢键氢键或在螺旋中相隔或在螺旋中相隔或在螺旋中相隔或在螺旋中相隔一圈残基一圈残基一圈残基一圈残基间间的离子相互作用的离子相互作用的离子相互作用的离子相互作用4 4〕运用在螺旋中相隔一圈的残基〕运用在螺旋中相隔一圈的残基〕运用在螺旋中相隔一圈的残基〕运用在螺旋中相隔一圈的残基间间疏水的范德疏水的范德疏水的范德疏水的范德华华相互作用相互作用相互作用相互作用5 5〕运用芳香〕运用芳香〕运用芳香〕运用芳香- -荷荷荷荷电电- -疏的相互作用疏的相互作用疏的相互作用疏的相互作用蛋白质从头设计的手段蛋白质从头设计的手段２．配体诱导组装 配位结合位点设计在构造中有几个相互作用片断的界面处。

假设这个位点对配体有很高的亲和力，那么结合配体的适宜的自在能将充分抑制熵耗费并且驱动肽自组装＋３．经过共价交叉衔接实现肽的自组装３．经过共价交叉衔接实现肽的自组装•设计全新蛋白的主要妨碍是肽链的构象熵当几个没有衔接的肽链进展自助装时，熵势垒比较难以抑制经过共价交叉衔接可以减少构象熵•自然界独一用于交叉衔接的方法是二硫键蛋白设计时用DAB４．在合成模板上肽的组装４．在合成模板上肽的组装•在模板上组装合成蛋白的方法•特点：运用人工合成的模板替代天然蛋白中的衔接二级构造的单元•模板：寡肽，可构成两个反平行β折叠链，设计一个Pro-Gly的转机在链的两端设计一个二硫键，构成一个环状构造５．线性多肽折叠为球状构造５．线性多肽折叠为球状构造•不用模板或交叉衔接而经过线性多肽折叠成球形确实定的三维构造是蛋白质设计追求的目的之一•主要妨碍：构象熵•实例:α-螺旋• 根据α-螺旋的两亲性构成的α-螺旋显著稳定性是由于构成明显的疏水核，还有Glu 和Lys构成的盐桥，螺旋偶极的电荷中和，添加了在螺旋/转机衔接处的柔性６．基于组合库的全新蛋白质设计６．基于组合库的全新蛋白质设计•中心问题：埋藏疏水部分•常用方法：二元方式 •实际根底：极性〔P〕和非极性〔N〕氨基酸的特性•含义：一方面要有利于构成二级构造，另一方面又要埋藏疏水残基•运用：二级构造两亲片断的构建P-N-P-N-P-NP-N-P-P-N-N-P-P-NPNPPPNNP非极性残基由非极性残基由DNADNA密码子密码子NTNNTN编码编码 N N：任何碱基：任何碱基极性残基由极性残基由DNADNA密码子密码子VANVAN编码编码 V V：：C C、、A A、、G G的混合的混合 二、蛋白质功能的全新设计二、蛋白质功能的全新设计• 蛋白质设计的目的是产生既能折叠为料想的蛋白质设计的目的是产生既能折叠为料想的构造又具有有趣和有用的功能。

功能设计主构造又具有有趣和有用的功能功能设计主要涉及键合及催化要涉及键合及催化•为到达这些目的可以采用两条不同的途径：为到达这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改动功反向实现蛋白质与工程底物的契合，改动功能；从头设计功能蛋白质能；从头设计功能蛋白质蛋白质的功能设计蛋白质的功能设计１．经过反向拟合天然蛋白质设计新的功能１．经过反向拟合天然蛋白质设计新的功能２．键合及催化的从头设计２．键合及催化的从头设计３．在全新蛋白质中引入结合位点３．在全新蛋白质中引入结合位点４．催化活性蛋白质的设计４．催化活性蛋白质的设计 ５．膜蛋白及离子通道的设计５．膜蛋白及离子通道的设计 ６．新资料的设计６．新资料的设计 第三节第三节 计算蛋白质设计计算蛋白质设计•蛋白质设计是一个实际与实验之间的循环这个循蛋白质设计是一个实际与实验之间的循环这个循环曾经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展环曾经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展•计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构象的离散化、残基分类象的离散化、残基分类( (内核、外表、边境内核、外表、边境) )、功能、功能位点设计、专注性、稳定性及序列空间的稳健性预位点设计、专注性、稳定性及序列空间的稳健性预测等方面内容测等方面内容。