质粒抽提技术.ppt

质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 基基因因工工程程移液器和EP管质质 粒粒•质粒主要发现于质粒主要发现于细菌细菌、、放线菌放线菌和和真菌真菌细胞中，细胞中，独独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧脱氧核糖核酸核糖核酸物质•质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等生素的抗性等F质粒质粒(又称又称F因子或性质粒因子或性质粒)、、R质质粒粒(抗药性因子抗药性因子)和和Col质粒质粒(产大肠杆菌素因子产大肠杆菌素因子)等等都是常见的天然质粒都是常见的天然质粒 •能稳定地能稳定地独立存在独立存在于染色体外，并传递到子代，于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上一般不整合到宿主染色体上•现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是常含抗生素抗性基因，是重组重组DNADNA技术技术中重要的工中重要的工具 分类：分类：u单拷贝质粒；单拷贝质粒；u多拷贝质粒多拷贝质粒；；l紧密控制型；紧密控制型；l松弛控制型；松弛控制型；质粒质粒DNADNA的提取方法的提取方法•碱裂解法；碱裂解法；•煮沸裂解法；煮沸裂解法；•酚氯仿抽提法；酚氯仿抽提法； 概括起来主要是用非离子型或离子型概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂去污剂、、有机溶剂或碱有机溶剂或碱进行处理及用进行处理及用加热加热处理。

处理基本思路基本思路1.1.培养细菌使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增；2.2.收集和收集和裂解细菌裂解细菌；；3.3.分离质粒分离质粒DNADNA( (有时还要求纯化质粒有时还要求纯化质粒DNADNA，，根据实验所需根据实验所需) )4.4.电泳检测；电泳检测；碱裂解法的基本原理碱裂解法的基本原理•十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(SDS)(SDS) 可使可使细胞膜裂解细胞膜裂解•经经SDSSDS处理后，细菌染色体处理后，细菌染色体DNADNA会缠绕附着在细胞碎片上，会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体同时由于细菌染色体DNADNA比质粒大得多，易受机械力和核比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段•当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体染色体DNADNA和蛋白和蛋白质变性质变性，而共价闭合环状，而共价闭合环状DNA(Covalently closed DNA(Covalently closed circularDNAcircularDNA，简称，简称cccDNA)cccDNA)的两条链不会相互分开。

的两条链不会相互分开•当外界条件恢复正常时，线状染色体当外界条件恢复正常时，线状染色体DNADNA片段难以复性，片段难以复性，而是与而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒，而质粒DNADNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中状态存在于液相中实验步骤实验步骤1 1、将含有质粒的、将含有质粒的DNADNA细菌在细菌在LBLB培养基中培养过夜取培养基中培养过夜取1.5ml 1.5ml LBLB培养液培养液倒入倒入1.5mleppendorf1.5mleppendorf管中，管中，4℃4℃下下4000rpm4000rpm离心离心5min5min 2 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽 3 3、菌体沉淀重悬浮于、菌体沉淀重悬浮于100μl100μl100μl100μl溶液溶液ⅠⅠ中（需剧烈振荡）中（需剧烈振荡） 4 4、加入新配制的、加入新配制的溶液溶液ⅡⅡ200μl200μl200μl200μl，盖紧管口，快速温和颠倒，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorfeppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴浴2 2分钟。

分钟 5 5、加入、加入150μl150μl150μl150μl预冷的预冷的溶液溶液ⅢⅢ，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中中5-105-10分钟，分钟，4℃4℃下下12000g12000g离心离心1010分钟6 6、上清液、上清液（（（（450uL450uL450uL450uL））））移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入等体积等体积的饱和酚的饱和酚（（1:11:1），充分颠倒混匀，），充分颠倒混匀，4℃4℃下下12000g12000g离心离心1010分分钟 7 7、将水相、将水相（（（（400uL400uL400uL400uL））））移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入等体积等体积酚酚/ /氯仿氯仿，颠倒混匀，，颠倒混匀，12000rpm12000rpm离心离心10min10min8 8、将水相、将水相（（（（350uL350uL350uL350uL））））移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入2 2倍体积倍体积的的无水乙醇无水乙醇，振荡混匀后置于，振荡混匀后置于-20℃-20℃冰箱中冰箱中2020分钟，然后分钟，然后4℃4℃下下12000g12000g离心离心1010分钟。

分钟 8 8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入加入0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml 7070％乙醇％乙醇洗沉淀一次，洗沉淀一次，4℃4℃下下12000g12000g离心离心1010分分钟 9 9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥燥1010分钟或室温干燥分钟或室温干燥 1010、将沉淀溶于、将沉淀溶于10μl TE10μl TE10μl TE10μl TE缓冲液（缓冲液（pH8.0pH8.0，含，含20μg/ml 20μg/ml RNaseARNaseA）中，储于）中，储于-20℃-20℃冰箱中LBLB液体培养基（液体培养基（Luria-Luria-BertaniBertani））•称取蛋白胨（称取蛋白胨（TryptoneTryptone））10g10g，酵母提取物，酵母提取物（（YeastextractYeastextract））5g5g，，NaCl10gNaCl10g，溶于，溶于800ml800ml去离子水中，用去离子水中，用NaOHNaOH调调pHpH至至7.57.5，加，加去离子水至总体积去离子水至总体积1 1升，高压下蒸气灭菌升，高压下蒸气灭菌2020分钟。

分钟溶液溶液I I•50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（（pH8.0），），10mmol/L　　EDTA（（pH8.0）溶液溶液Ⅰ可成批配制，每瓶可成批配制，每瓶100ml，，高压灭菌高压灭菌15分钟，储存于分钟，储存于4℃冰箱冰箱u溶液溶液I I：重悬细菌；：重悬细菌；u葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；uTrisTris－－HClHCl：缓冲体系；：缓冲体系；uEDTAEDTA：螯合金属离子；：螯合金属离子；溶液溶液ⅡⅡ•1mol/L NaOH 200 l •10% SDS 100   l•H2O 700   lu溶液溶液IIII————破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNADNA和蛋白质；和蛋白质；uSDSSDS————破膜作用，破膜作用，解聚核蛋白并与蛋白质解聚核蛋白并与蛋白质 分子结合使之变性分子结合使之变性 ；；uNaOHNaOH————(pH>12)，破坏氢键，破坏氢键，变性基因组，变性基因组DNADNA；；溶液溶液ⅢⅢ•5mol/LKAc60ml，，冰醋酸冰醋酸11.5ml，，H2O 28.5ml，，定容至定容至100ml，，并高压灭菌。

溶液并高压灭菌溶液终浓度为：终浓度为：K+3mol/L，，Acˉ5mol/Lu溶液溶液IIIIII————中和溶液，复性质粒中和溶液，复性质粒DNADNA；；酚酚/ /氯仿（氯仿（1:11:1））u酚酚————变性蛋白质；变性蛋白质；u氯仿氯仿————萃取溶液中的酚；萃取溶液中的酚； 分为两层，上层为水层，下层为酚氯分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液吸取时不要震荡仿混合液吸取时不要震荡乙醇乙醇u无水乙醇（无水乙醇（2 2倍体积）倍体积）————沉淀质粒沉淀质粒DNADNA；；u70%70%乙醇乙醇————洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀，除沉淀，除去沉淀中的盐分；去沉淀中的盐分；琼脂糖凝胶•从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶•凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。

因此琼脂糖凝胶可作为浓度因此琼脂糖凝胶可作为分子筛分子筛，常用于，常用于凝凝胶层析和电泳胶层析和电泳 电泳6×loading buffer 2ml样品 10mlMarker 10ml•120V, 电泳30min，•电泳结束，紫外灯下观察结果混匀，上样混匀，上样混匀，上样混匀，上样BM 5000 DNA Marker电泳鉴定电泳鉴定•其中其中超螺旋结构超螺旋结构泳动最快；泳动最快；•其次为其次为线性结构；线性结构；•最慢的可能是最慢的可能是复制中间体复制中间体（没有复制完的两（没有复制完的两个质粒连在一起）；个质粒连在一起）；。