ELISA IL-6(人白介素) 操作流程.doc

人白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒运用说明书产品编号：1910231 本试剂盒仅供体外探讨运用、不用于临床诊断!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培育上清或其它相关生物液体中IL-6含量试验原理用纯化的IL-6抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的IL-6抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色颜色的深浅和样品中的IL-6呈正相关用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度 试剂盒组成及试剂配制 1、 酶标板：一块（96孔） 2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10,000 pg/ml，将其稀释为500 pg/ml后，再做系列倍比稀释（注：不要干脆在板中进行倍比稀释），分别配制成500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml，7.8 pg/ml，样品稀释液干脆作为空白孔 0 pg/ml。

如配制500 pg/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）500 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推3、 样品稀释液：1×25ml4、 人白介素6:1×25ml5、 HRP,100X：1×150 /瓶（1:100）临用前以HRP 1:100稀释（如：10 HRP / 990 HRP稀释液），充分混匀，稀释前依据预先计算好的每次试验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml6、 HRP稀释剂：1×12ml7、 浓洗涤液：1×50ml/瓶运用时每瓶用蒸馏水稀释10倍8、 底物溶液：1×12ml/瓶， 9、 终止液：1×12ml/瓶（2 mol/L H2SO4）10、覆膜：4张11、运用说明书：1份自备物品 1、 酶标仪（建议仪器运用前提前预热）2、 微量加液器及吸头，EP管3、 蒸馏水或去离子水，滤纸 标本的采集及保存 1、 血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避开反复冻融2、 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避开反复冻融。

3、 细胞培育物上清或其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避开反复冻融 注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超过2个月；标本溶血会影响最终检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测操作步骤试验起先前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能干脆在室温溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避开起泡试验前应预料样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔空白孔加样品稀释液 100 ，余孔分别加标准品或待测样品100，留意不要有气泡，加样 时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，室温温育2小时为保证明验结果有效性，每次试验请运用新的标准品溶液2、 洗涤：弃掉板孔中的液体，加满洗涤液，静止放十秒，洗四次，最终在毛巾或吸水纸上拍干板子：3、 每孔加HRP（临用前配制）100，加上覆膜，室温温育1小时4、 洗涤：同其次步5、 每孔加底物溶液100，酶标板加上覆膜室温避光显色（反应时间限制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。

6、 每孔加终止溶液100，终止反应，此时蓝色立转黄色终止液的加入依次应尽量与底物 液的加入依次相同，马上渎数7、 马上用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）注：1、 试剂打算：全部试剂在运用前应平衡至室温，运用后请马上依据说明书要求保存试剂试验操作中请运用一次性的吸头，避开交叉污染2、 加样：加样或加试剂时，第一个孔与最终一个孔加样之间的时间间隔假如太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的精确性及重复性一次加样时间（包括标准品及全部样品）最好限制在10分钟内举荐设置复孔进行试验3、 温育：为防止样品蒸发，试验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避开液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避开酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度4、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸干脆放入反应孔中吸水，同时要消退板底残留的液体和手指印，避开影响最终的酶标仪读数5、 反应时间的限制：加入底物后请定时视察反应孔的颜色改变（比如，每隔10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避开反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

6、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避开强光干脆照耀 洗板方法1、 手工洗板方法：将举荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去（不行触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在试验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；依据须要，重复此过程数次2、 自动洗板：假如有自动洗板机，应在娴熟运用后再用到正式试验过程中特异性 本试剂盒可同时检测重组或自然的人IL-6，且与其它相关蛋白无交叉反应计算 各标准品及样本 值扣除空白孔 值后作图（七点图），如设置复孔，则 应取其平均值计算以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线举荐运用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert 1.3，依据样品值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 值计算出标准曲线的回来方程式，将样品的 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度 检测范围： 7.8 pg/ml - 500 pg/ml，绘制标准曲线请取用以下浓度值：500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml，7.8 pg/ml。

最低检测限：7.8 pg/ml。