中药色谱指纹图谱双层次控制模型理论和应用讨论.doc

中药色谱指纹图谱双层次控制模型理论和应用讨论=“news_bd”> 　　天王补心丸(Tianwang Buxin pill，TWBXP)由丹参、当归、石菖蒲、党参、茯苓、五味子、麦冬、天冬、地黄、玄参、远志(制)、酸枣仁(炒)、柏子仁、桔梗、甘草和朱砂等16 味药材组成，是滋阴养血和补心安神名方文献中有薄层扫描法、HPLC 法测定单组分或几个组分含量研究本文深入探讨中药指纹图谱控制本质、质控模式和方法，对其进行深层次的理论分析，提出中药色谱指纹图谱双层次控制模式理论从中药指纹图谱保留时间和相对保留时间(RT)进行色谱系统适用性鉴定和时间系统定量，对复制标准建立时的色谱检验系统进行鉴别目前，国内外通行的标准指纹图谱是一个数学统计指纹图谱，借助于计算机软件技术来建立，因其固定不变性导致存在很多弊端孙国祥等一直主张建立标准制剂控制模式，这也是中药指纹图谱发展的必然和归宿，因其符合当前国际关于药物质量控制的通行规范，是中药指纹图谱进行中药质控和质检的有效措施　　本文通过建立246 nm-TWBXPs-HPLC 指纹图谱，应用中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0软件计算相对特征指纹图谱，以TWBXP 对照指纹图谱计算其特征指纹图谱(RCFP)作为控制指纹图谱检测系统的第一层次，作为系统适用性试验的一部分。

用中药指纹图谱双层次控制模型理论评价TWBXP-HPLC 指纹图谱本文首次透视中药指纹图谱国内外控制规律，找到了中药指纹图谱双层次控制理论的本质和方法在正确地解析中药指纹图谱控制规律和模式同时，为中药标准制剂控制模式和定量指纹图谱模式走向中药工业化控制奠定了理论基础中药指纹图谱从宏观角度对中药化学组分进行整体量化控制具有科学性和可靠性，符合中药经典理论- 整体论中药标准制剂控制模式和中药定量指纹图谱控制模式为中药质量整体控制论完成理论和技术上的奠基　　1 中药色谱指纹图谱双层次控制模型理论　　1.1 中药色谱指纹图谱的双层次控制模型　　中药指纹图谱控制是双层次控制，第一层次控制采用特征指纹图谱控制模式[ 孙国祥等用各指纹峰相对峰面积(RA)对RT 作图得相对特征指纹图谱RCFP，简称特征指纹图谱]RCFP 强调检测时样品图谱的RT 和RA与对应的RCFP 要高度一致性RCFP 是对实物指纹图谱特征的升华，因此也称永恒指纹图谱，是中药指纹图谱的气态中国药典委在中药指纹图谱技术指导原则中强调公布指纹图谱特征技术参数，其实就是有意无意地在利用RCFP 对色谱系统进行适用性控制与对色谱系统基本功能进行必要控制：　　① 一直以来国内外没有注意到该技术层面在客观上存在巨大困难，其不应定位在对系统RT 和RA 变动幅度的控制方面(属于定量)，这机械地、理想化地和苛求地限制了中药指纹图谱的检验标准的适用性;　　② 该方法建立在色谱系统高度重现的基础上，限制指纹峰RT 变动幅度和RA 变动范围必然扼杀中药和植物药产品的生命，源于该技术标准根本不符合客观规律，是机械论盛行导致的脱离现实;　　③ 采用样品指纹图谱的RT 和RA 与特征指纹图谱的对应系列标准进行夹角余弦的定性鉴定作为色谱系统适用性试验(不低于0.90)的一部分内容最为合理，绝不能以幅度变动方式控制单一或几组指纹峰，事实上即使满足此标准也不代表产品质量的过关与合格;　　④ 利用参照峰校正系数对 RCFP 进行准确校正后，可对样品进行准确地整体定量(因为这种校正返回原谱)。

　　第二层次控制采用实物指纹图谱控制即标准指纹图谱控制模式，其实质是色谱系统直接检测获得的标准色谱指纹图谱　　① 标准指纹图谱控制模式，目前国内外广泛采用了这种固定的标准指纹图谱控制模式，是基于研究时建立的统计指纹图谱为标准因为一旦研究好标准指纹图谱这种固定模式后，检验人员和研究人员都不再考虑其应用时的检验系统与标准建立时所用的色谱系统之间的可能存在的任何差异，尽管第一层次对检验用色谱系统进行严格规定和规范，但检验色谱系统无法准确复制当初建立标准指纹图谱的色谱系统而使色谱条件真实状态的完全等价一致，两者之间存在巨大的矛盾和不可调和的不确定度目前这是中药色谱指纹图谱的技术死角和无法克服的矛盾因此这种指纹图谱也叫固体指纹图谱，代表图谱的一种固体状态，所以是呆板指纹图谱，保守不灵活和误差极大是其基本特征　　② 标准制剂控制模式，孙国祥教授在近十几年研究定量指纹图谱过程中始终提倡第二层次控制应采用标准制剂控制模式，以其(标准药材、标准饮片、标准提取物、标准配方颗粒和标准制剂)提取液即时检测采集色谱指纹数据作为标准指纹图谱，也称机动标准指纹图谱，之后马上检验样品指纹图谱，用前者直接测评后者其完全消除了2 个色谱系统间可能存在的各种误差并符合当前国际对西药控制的通行方法与理念(随行对照法)。

用标准制剂控制法检测获得的标准指纹图谱也称液体标准指纹图谱，特点就像液体具有极好的适用性和应变性，不因检测系统改变而产生检测误差当然由标准制剂获得的标准指纹图谱与固定标准(对照)指纹图谱之间也接受相应的检测合约与协定国内外文献中有检测标准提取物和道地药材提取液的图谱作为标准指纹图谱的做法，日本早以道地药材制备的制剂作为检验生产制剂的标准，具有创新性和科学性中药指纹图谱是双层次控制，两者紧密一统不可分割，是基础和建筑的关系，是特征与实物的统一与协调一层次司定性，二层次司定量中药现代化和国际化必须利用好中药指纹图谱的一般控制(定性鉴别)和高级控制(整体定量)功能中药指纹图谱是复杂的系统也是简单的系统，是整体和特征的有机统一认清实质有助于对中药指纹图谱控制进入深层次研究，中药指纹图谱双层次控制模式理论是第一次从理论层面揭示中药指纹图谱控制方式要进行深入研究，不能简单一蹴而就中药指纹图谱评价没有想象那样简单和容易，实际上是对复杂体系的重点和关键控制　　1.2 双层次控制模型下的定性相似度理论　　1.2.1 第一层平面定性相似度(L1-S) 用特征指纹峰相对保留时间计算定性相似度并乘以相对峰面积计算的定性相似度，两者平方根称为第一层平面定性相似度SL1，见(1)式。

　　1.2.2 第二层平面定性相似度(L2-S) 用指纹峰保留时间计算定性相似度并乘以用峰面积计算定性相似度，两者平方根称为第二层平面定性相似度SL2，见(2)式　　1.2.3 立体定性相似度(3D-S) 用指纹峰面积计算定性相似度并乘以第一层平面定性相似度的平方，结果的立方根称为立体定性相似度S3D，见(3)式　　1.2.4 四维定性相似度(4D-S) 第一层平面定性相似度乘以第二层平面定性相似度，其方根称为四维定性相似度S4D　　2.1 仪器和试药　　Agilent 1100 型液相色谱仪(配有二极管阵列检测器、四元低压梯度泵、脱气装置、自动进样器)，Chem Station 工作站(Agilent 科技有限公司)，Arturius-BS110S 分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)阿魏酸(ferulic acid，FA，批号：0773-9910)、5- 羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF， 批号：111626-200503)和甘草酸铵(glycyrrhizic acid ammonium salt，GHIA，批号：110731-200407)对照品(中国食品药品检定研究院，供含量测定用)。

甲醇、乙腈(色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂)，磷酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，95% 乙醇(分析纯，沈阳市富康消毒药剂厂)，水为去离子水12 批TWBXPs(大蜜丸)(沈阳各药店)　　2.2 对照品溶液制备　　精密称取FA 对照品5 mg，以甲醇定容至10 mL 量瓶中，摇匀，即得0.5 mgmL- 1 FA 对照品溶液;同法配制0.5 mgmL- 1 GHIA 溶液和1 mgmL- 1 5-HMF 对照品溶液　　2.3 供试品溶液制备　　取 TWBXPs 1 丸约9 g，精密称定，加甲醇50 mL，回流1 h，滤过;残渣加甲醇50 mL，回流提取1 h，滤过;合并2 次滤液，减压浓缩至约10 mL，以甲醇定容至25mL 量瓶中，摇匀即得进样前用0.45 μm 滤膜过滤　　2.4 色谱条件　　Century SIL C18 BDS 柱(200 mm×4.6 nm，5 μm)，流动相：A 为0.2% 磷酸水溶液，B 为0.1% 磷酸乙腈，线性梯度：0 ～ 10 min，0% ～ 5%B;10 ～ 30 min，5% ～ 15%B;30 ～ 50 min，30% ～ 55%B;50 ～ 70min，55% ～ 75%B;70 ～ 85 min，75%B。

紫外检测波长246 nm，柱温(30.0±0.15)℃，进样量5 μL，流速1.0mLmin - 1，洗脱85 min　　3 结果与讨论　　3.1 系统适用性试验　　将各对照品溶液和 S1 供试液分别进样5 μL，记录246 nm 色谱图对比保留时间和紫外光谱确定7、18、32 号峰分别5-HMF、FA 和GHIA选择GHIA 作参照物峰，其理论塔板数为51.5 万各批样品指纹图谱的SL1、SL2、S3D、S4D 均≥ 0.90　　3.2 方法学考察　　精密吸取 S2 样品供试液5 μL，连续进样5 次，记录色谱图取S2 样品分别在制备样品后的0、3、6、12 和24 h 进样测定，记录色谱图取S2 样品平行制备5 份供试液，精密吸取5 μL 在HPLC 仪上进样并检测，记录色谱图以32 号峰(GHIA)的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰RT 的RSD 均< 1.0%，RA 的RSD 均< 3.0%，表明方法精密度和重复性良好，样品在24 h 内稳定　　3.3 TWBXP-HPLC 指纹图谱建立　　将 12 批TWBXPs 供试液分别进样检测并记录色谱图见图3。

以32 号峰(GHIA)为参照物峰按峰出现率100% 计确定46 个共有峰按平均值法生成标准对照指纹图谱(PRFP)并计算12 批样品的宏定性相似度Sm 和宏定量相似度Pm以Sm 和Pm 为参量进行系统聚类分析，结果S1、S2、S3、S7 和S12 为第1 类，S6 和S11 为第2 类，S4、S5、S8、S9 和S10 为第3 类选择第1，3类样品，用孙国祥等研制的中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0软件按平均值法生成对照指纹图谱(RFP)重新评价各批次样品质量结果见表1计算获得TWBXP PRFP(见图4B)和RCFP__由RFP 特征技术参数作图得到的相对特征指纹图谱是对照指纹图谱控制的第一层次，具有永恒性以RFP 为评价标准，用系统比率指纹定量法(见5 ～ 7式)评价TWBXPs 的Sm 均≥ 0.89(S12 除外)，除S12外11 批质量均为好(3 级以内)　　4 结论　　本文提出中药色谱指纹图谱双层次控制模式理论从两个平面定性相似度三维和四维定性相似度进行色谱系统适用性鉴定通过建立246 nm-TWBXPs-HPLC 定量指纹图谱，以其对照指纹图谱计算其特征指纹图谱作为控制指纹图谱检测系统的第一层次，所有峰保留时间和RT 和RA 与RFP 的定性相似度作为系统适用性试验的一部分。

本文首次透视中药指纹图谱国内外控制规律，找到了中药指纹图谱双层次控制理论的本质和技术方法在正确地解析中药指纹图谱控制规律和模式同时，本文为中药标准制剂控制模式和中药定量指纹图谱控制模式走向工业化控制在理论上进行了重要的基础铺垫。