液相色谱串联质谱联用技术-实验指导许煊炜.doc

液相色谱串联质谱联用仪检测技术实 验 指 导（2014、2015级）课程内容（一个实验8学时）：（1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量吉林农业大学 农业部参茸质检中心2017.03实验一 AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用一 .实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等一）检测仪器 1、 仪器名称 高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。

2、 仪器组成 液相色谱部分：岛津 LC-30A，配有脱气机、超高压二元泵、自动进样器； 串联质谱部分： QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱 3、 主要性能指标 离子化方式：ESI电离 质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围）4、 方法原理 高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器 4500QTRAP的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。

各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图 4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成 （二）样品 1、样品要求 本仪器适合分子量在5 ~ 1700 amu范围内的有机样品的定性及定量分析待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液 2、试剂要求 所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于18KΩ流动相必须用0.2µm或0.45µm滤膜过滤后方可使用 3、分离条件要求 在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐 （三）、操作步骤 实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求 1、 开机前准备 开机前应检查仪器室内电、气的供应情况及空调机的工作状态是否稳定，检查真空机械泵泵油是否需要更换。

只有当UPS工作正常，Gas1/Gas2、Curtain Gas和Exhaust Gas的压力分别稳定在0.35、0.35和0.7 Mpa，环境温度为10~30℃，相对湿度小于70%时才能开机 2、开机 1) 打开真空机械泵上的电源开关 2) 真空机械泵继续工作至少15分钟后，打开MS电源主开关 3) 等真空度达到2×10-5Torr（绿色指示灯不闪）后，打开PC计算机电源3、仪器调谐 （四）、方法建立1.在Analyst软件Tools菜单中选择Project→Create Project在Project name项下输入新建的Project名称注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Project2.在Analyst软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration在弹出窗口中选择MassOnly，点击Activate Profile，激活MassOnly（只联接质谱主机）3.在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式点击上方工具条中的T钮此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态此时右下角质谱状态显示绿色双击Manual Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。

4.使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上点击MS Method下拉菜单，选择Syringe Pump Method，设定针泵流速Flow Rate为10μL/min5.点击Start Syringe Pump按钮开针泵进样6.返回MS Method，选择扫描模式Scan Type为Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate为10Da/s，设定扫描范围Start——Stop设定为50——化合物分子量DP预输入607.点击start开始采集数据运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约E4以下点击stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子点击右键，选择Delete Pane8.设定Scan type为产物离子扫描Product Ion（Ms2），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（product of），设定扫描范围start——stop为50——MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击compoud标签，设定（DP）60，（CE）59.点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。

每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见选择平稳的一段，双击，选择子离子10.选择Scan Type为MRM设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，time（ms）为50，ID值设为名称 1（定量），名称 2（定性）11.点击Edit Ramp，在Parameter下选择Collision Energy，点击OK点击start开始采集数据，记录每个MRM通道的最佳CE电压在MRM参数设定表中，右键点击选择Collision Energy CE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数重复以上步骤，在Parameter项下选择Declustering Potential，优化并保存DP完成后选择菜单File/Save保存采样方法，[文件名].dam五）LCMS方法的建立：1、连接仪器：打开 HPLC质谱电源，将 HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与离子源连好调离子源喷雾针位置到2mm处，双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击LCMS ( 液相与质谱联用 )，单击Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。

2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击Build acquisition method新建方法，弹出新建方法模板在模板左侧点击acquisition method，模板右边显示对应的参数，确认synchronization mode选择LC Sync,表示液质同步3、设置MRM参数：点击方法模板左侧的MRM, 在模板右侧 Scan Type下选择MRM；在polarity下选择化合物极性：Positive(正离子)、Negative（负离子）；Duration为15min(与液相分离相同的时间)；表格中Q1：母离子分子量，Q3(Da)：子离子分子量，Time（msec）：50，ID栏：化合物名称（离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行，Ctrl+c(复制)参数，关闭窗口，再Ctrl+v(粘贴)参数）；最后点击Edit parameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子) 或-4500（负离子），TEM 600，GS1 60，GS270，点击OK。

4、设置液相参数：点击模板左边的shimadzu LC system，①在右边的pumps栏下，设置stop time （运行时间）为15min， flow流速为1mL/min，A为水相设为95%，B为有机相设为5%（设置时改B，A自动），泵最大压力为50；点击time program设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min)AB---95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%②接着在右边的Auto sampler栏下，设置清洗时间，在Rinse mode 下选择Before and after(前后都洗)，并设置清洗时间为5s，清洗液用50%甲醇水最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称五）数据处理双击打开Multiquilt，选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据），设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组），并指定内标，next，对每个物质进行积分设置积分参数：CausianSmoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；Expeceted Time（保留时间）:一般不动Expected time范围：一般30s，表示在保留时间±15s范围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。

分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物点击next，点击finish在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线实验二 利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量1　 实验目的：1.1　 让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析流程1.2　 利用前2节课所学内容实际处理样品，增强学生实践能力1.3　 进一步加强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理2　 试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682 规定的二级水2.1　 乙腈(C2H3N)：色谱纯2.2　 氯化钠(NaCl)：140 ℃干燥4 h2.3　 氨基固相萃取小柱：500 mg/6 mL(或性能相当的其它固相萃取柱)2.4　 二氯甲烷-甲醇混合液。